脊髓灰质炎病毒株的鉴定制造技术

本发明专利技术涉及用于鉴定和/或区分脊髓灰质炎病毒株尤其是用于疫苗生产的脊髓灰质炎病毒株的方法。所述方法基于使用寡核苷酸(即，引物和/或探针)的选择性杂交，所述方法使得能够根据那些脊髓灰质炎病毒株之间存在的核苷酸多态性来区分紧密相关但又不相同的脊髓灰质炎病毒株。优选地，所述方法采用用于检测选择性杂交的扩增测定或扩增-连接测定。本发明专利技术还涉及用于本发明专利技术的方法的寡核苷酸和包含这种寡核苷酸和任选的用于实施本发明专利技术的方法的酶和缓冲液的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及用于鉴定和/或区分脊髓灰质炎病毒株尤其是用于疫苗生产的脊髓灰质炎病毒株的方法。所述方法基于使用寡核苷酸(即，引物和/或探针)的选择性杂交，所述方法使得能够根据那些脊髓灰质炎病毒株之间存在的核苷酸多态性来区分紧密相关但又不相同的脊髓灰质炎病毒株。优选地，所述方法采用用于检测选择性杂交的扩增测定或扩增-连接测定。本专利技术还涉及用于本专利技术的方法的寡核苷酸和包含这种寡核苷酸和任选的用于实施本专利技术的方法的酶和缓冲液的试剂盒。【专利说明】脊髓灰质炎病毒株的鉴定
本专利技术涉及病毒学和病毒疫苗学领域。具体地，本专利技术涉及用于鉴定疫苗专用脊 髓灰质炎病毒株的工具和方法。
技术介绍
活的减毒的口服脊髓灰质炎疫苗（0PV)和灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗（IPV)的使 用已经显著地减少了脊髓灰质炎的病例数目和脊髓灰质炎的爆发（Dutta，2008 ;Crawford and Buttery，2010)。世界卫生组织（WHO)的全球根除脊髓灰质炎行动（Global Polio Eradication Initiative)目前将注意力集中在消灭疾病和根除野生脊髓灰质炎病毒上 (WH0, 2003 ;Sutter et al.，2003)。尽管在普及性疫苗接种方面付出了很大努力，但是在最 近几年中仍然报道了几十例脊髓灰质炎病例（Crawford and Buttery, 2010 ;Global Polio Eradication Initiative. Global polio case count. 2011.可获自：（Novl4,2011 取得 的）；Kew et al.，2005)。用0PV接种疫苗可引入疫苗衍生脊髓灰质炎病毒，导致脊髓灰质 炎的爆发（Kew et al.，2005)。这些疫苗衍生脊髓灰质炎病毒中有一些有高毒力并且是可 传染的（Boot et al.，2004;Kew et al.，2005)。显然，IPV不会有这个缺点。然而，目前 IPV的生产能力非常有限，IPV使用的增加要求建立更多的生产设备。这些设备必须应对 密闭性方面严苛的安排，因为IPV是使用有毒力的脊髓灰质炎毒株生产的（2003)。因此， WHO决定促进开发基于减毒的脊髓灰质炎病毒（例如Sabin毒株）的IPV(Heymann et al.， 2005 ;Heymann et al. ,2006)。因此，即使不能完全消除从生产设备逃逸的病毒造成有害影 响或意外感染制造人员的风险，但是可使上述风险降到最低（Kew et al. ,2005)。 在基于野生型毒株的IPV向基于Sabin毒株的IPV转变的过程中，IPV的生产者 可能既使用野生型脊髓灰质炎病毒株也使用减毒的脊髓灰质炎病毒株（表1)。明确地鉴定 用于IPV生产的脊髓灰质炎病毒株对于疫苗发放而言是重要的质量控制试验。目前，血清 学方法用于鉴定和定量化IPV中存在的三种脊髓灰质炎病毒血清型，但是其通常不能区分 野生型疫苗毒株和减毒的疫苗毒株（Westdijk et al.，2011)。尽管可以使用能够区分野 生型脊髓灰质炎病毒株和减毒的脊髓灰质炎病毒株的血清学测定，但是所述血清学测定需 要高度特异性的抗血清（van der Avoort et al. ,1995)，所述高度特异性的抗血清的制备 是复杂并且费时费力的（van Wezel and Hazendonk，1979)。或者可鉴定野生型或减毒的 脊髓灰质炎病毒株的分子生物学方法可用于常规分析野生（field)分离株中的脊髓灰质炎 病毒。所述技术基于核酸杂交（Kilpatrick et al·，1996)或逆转录PCR(Kilpatrick et al·，1998 ;Boot et al·，2004 ;Kilpatrick et al·，2004 ;Kilpatrick et al·，2009)。每 种技术都有其自身的优点和缺点（表2)。然而，必须将文献中描述的这些方法改变后，才可 将其用于鉴定疫苗专用的脊髓灰质炎病毒株。因此，本领域仍然需要使得能够快速且准确 地鉴定和区分疫苗生产中使用的多种疫苗专用脊髓灰质炎病毒株的方法和工具，所述脊髓 灰质炎病毒株包括例如 Mahoney、MEF-1、Saukett H、Sabinl 型、Sabin2 型和 Sabin3 型。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术涉及一种用于鉴定样品中的脊髓灰质炎病毒株的方法，其中 所述方法包括寡核苷酸与样品中的脊髓灰质炎病毒核酸选择性杂交的步骤，其中所述寡 核苷酸是以下寡核酸中的至少一种：a)包含SEQ ID N0 :1或其互补物的至少12个连续核 苷酸的寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID NO: 1或其互 补物第1942-1944位的序列；b)包含SEQ ID NO :1或其互补物的至少12个连续核苷酸 的寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID NO: 1或其互补物 的第3894-3896位的序列；c)包含SEQ ID N0 :2或其互补物的至少12个连续核苷酸的 寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID N0 :2或其互补物的 第1942-1944位的序列；和d)包含SEQ ID N0 :2或其互补物的至少12个连续核苷酸的 寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID N0 :2或其互补物的 第3894-3896位的序列；其中，与a)中寡核苷酸选择性杂交表明存在选自Mahoneyl型、 Brunhilde、CHAT和Cox的脊髓灰质炎病毒株；与b)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在 Mahoneyl型脊髓灰质炎病毒株；与c)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在Sab ini型脊髓灰 质炎病毒株；与d)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在选自Sabinl型、CHAT和Cox的脊髓 灰质炎病毒株。优选地，在所述方法中，所述寡核苷酸包含相对于SEQ ID N0 :1和2或其互 补物的错配，更优选地，所述错配在对应SEQ ID N0 :1的第1940位、第1946位、第3892位 或第3898位的位置上。在本专利技术方法的一个实施方案中，寡核苷酸的选择性杂交是通过扩 增测定或扩增-连接测定来检测。 在本专利技术的优选实施方案中，所述方法包括以下步骤：a)用包括正向引物和反 向引物的引物对扩增样品中的脊髓灰质炎病毒核酸的至少一部分，所述正向引物为以 下引物中的至少一种：（i)包含序列：5' -CCCTTTGACTTAAGTHCCAC-3'的至少12个连续 核苷酸和3 '末端的正向引物，其中Η是不能与C碱基配对的核苷酸；（ii)包含序列： 5' -CCCTTTGACTTAAGTHCAAA-3'的至少12个连续核苷酸和:V末端的正向引物，其中Η是 不能与C碱基配对的核苷酸；（iii)包含序列：5' -CCATGGTGTTCTTTTVTGTG-3'的至少12个 连续核苷酸和3'末端的正向引物，其中V是不能与A碱基配对的核苷酸；（iv)包含序列： 5' -CCATGGTGTTCTTTTVTTTT-3'的至少12个连续核苷酸和3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定样品中的脊髓灰质炎病毒株的方法，其中所述方法包括使寡核苷酸与所述样品中的脊髓灰质炎病毒核酸选择性杂交的步骤，其中所述寡核苷酸是以下寡核苷酸中的至少一种：a)包含SEQ ID NO：1或其互补物的至少12个连续核苷酸的寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在5′末端或3′末端包含SEQ ID NO：1或其互补物的第1942‑1944位的序列；b)包含SEQ ID NO：1或其互补物的至少12个连续核苷酸的寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在5′末端或3′末端包含SEQ ID NO：1或其互补物的第3894‑3896位的序列；c)包含SEQ ID NO：2或其互补物的至少12个连续核苷酸的寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在5′末端或3′末端包含SEQ ID NO：2或其互补物的第1942‑1944位的序列；和，d)包含SEQ ID NO：2或其互补物的至少12个连续核苷酸的寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在5′末端或3′末端包含SEQ ID NO：2或其互补物的第3894‑3896位的序列；其中，与a)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在选自Mahoney1型、Brunhilde、CHAT和Cox的脊髓灰质炎病毒株；与b)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在Mahoney1型脊髓灰质炎病毒株；与c)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在Sabin1型脊髓灰质炎病毒株；与d)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在选自Sabin1型、CHAT和Cox的脊髓灰质炎病毒株。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·梅茨，O·E·M·尼斯特，J·J·毛斯哈恩，D·R·梅克斯，
申请(专利权)人：由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL