预防再激活的结核病TB疫苗制造技术

本发明专利技术公开可向潜伏感染个体施用以预防结核病复合群微生物物种（结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分枝杆菌（M.bovis）、非洲分枝杆菌（M.africanum））引起的潜伏结核病感染的再激活的疫苗或者免疫原性组合物。本发明专利技术是基于在感染的不同阶段组成型表达的大量结核分枝杆菌来源的蛋白和蛋白片段。本发明专利技术涉及这些多肽、其免疫活性片段和编码它们的基因用于免疫组合物诸如疫苗的用途。

【技术实现步骤摘要】
预防再激活的结核病TB疫苗本申请是申请日为2010年4月23日，申请号为“201080017717.7”，专利技术名称为“预防再激活的结核病TB疫苗”的申请的分案申请。专利
本专利技术公开可向潜伏感染个体施用以通过靶向组成型表达的抗原诸如ESAT6、CFP10和来自ESX-1分泌系统的其他抗原而预防结核病复合群微生物（tuberculosiscomplexmicroorganisms）物种（结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）、牛分枝杆菌（M.bovis）、非洲分枝杆菌（M.africanum））引起的潜伏结核病感染的再激活的疫苗。一般背景由结核分枝杆菌（M.tuberculosis）引起的人类结核病是一个严重的全球性健康问题，根据WHO，其造成每年约3百万人死亡。在二十世纪60年代和70年代期间，全世界新的结核病（TB）病例发生率已经处于下降中，但在近十年中，部分由于AIDS的来临和结核分枝杆菌的多药抗性菌株的出现，这种趋势已经发生明显的改变。结核病复合群（tuberculosiscomplex）的生物体可引起多种疾病，但最常见的侵入途径是通过吸入细菌。这在肺中开始感染，最终可扩散到身体其他部位。通常，这种感染在生长方面被免疫系统限制，使得大多数感染个体除了最终减退的咳嗽和发热以外显示极少的体征。大约30%的个体不能容纳感染，将发展原发性疾病，这在许多情况中最终将是致命的。然而，认为甚至表面上控制感染的那些个体仍保持被感染，很可能持续其余生。当然，已经健康了数年或甚至数十年的个体可能突然发展结核病，该结核病被证明是多年前其感染的相同生物体引起的。结核分枝杆菌和TB复合群的其他生物体的独特之处在于，分枝杆菌可躲避免疫应答，以难治的非复制或缓慢复制期存活长时间。这称为潜伏TB，目前是非常严重的全球性健康问题，估计影响全世界人群的大约1/3（Anon.,2001）。目前唯一可供临床使用的疫苗是BCG，该疫苗的效力仍然有些争议。虽然BCG在原代感染的动物模型中一直表现良好，但它显然未能控制TB流行。与此一致，BCG接种表现为提供抵抗儿科TB（由于原代感染）的保护，而对抵抗成年疾病（通常是童年获得的潜伏感染的再激活）提供极小或没有保护。还已显示，向目前对分枝杆菌敏感或潜伏感染的个体接种疫苗是无效的。结核分枝杆菌感染的过程主要经历3个时期，如图1所示。在急性期，细菌在器官中增殖，直到免疫应答增强到其可控制感染的点，此时细菌负荷（bacterialload）达到峰值并开始下降。此后，在细菌负荷稳定维持在低水平时形成潜伏期。在这个时期，目前认为结核分枝杆菌由活跃的增殖趋于休眠期，基本上转变为非复制状态并维持在肉芽肿内。然而，近来已经变得明显的是，即使在特征为恒定的低细菌数目的感染阶段，至少部分细菌群体仍保持活性代谢的状态（TalaatAM等2007）。因此，尽管有强的免疫应答，这些细菌存活，保持活性代谢和复制。所以，在感染个体中，存在非复制细菌（因为位于胞内，免疫系统可能难以检测到）与缓慢复制细菌之间的平衡，所述缓慢复制细菌具有活性但改变的表达谱，试图适应在免疫宿主中遇到的敌对环境。处于这一阶段的细菌通常不被TB领域中目前正开发的大多数预防性疫苗所靶向，例证是当典型的预防性疫苗被提供给潜伏感染的实验动物时缺乏活性（Turner2000）。在一些情况中，由于病原菌和感染进入再激活阶段，这一平衡被倾斜，在再激活阶段细菌开始快速复制并且感染个体中的细菌数目增加。在潜伏感染个体中、在非常强的免疫压力下复制的细菌是本专利技术接种策略的靶。处于这一潜伏感染阶段的细菌通常不被TB领域中目前正开发的大多数预防性疫苗所靶向，例证是当预防性疫苗被提供给潜伏感染的实验动物时缺乏活性（Turner等2000）。这不令人惊讶，因为现在已知强的宿主免疫应答导致许多抗原诸如主要预防性疫苗抗原Ag85和PstS的下调（Rogerson,BJ等2006）。对于Ag85B，已经显示，在感染后存在Ag85B表达的最初短暂增加，但在感染后2周，细菌Ag85B表达水平已经从峰值期间的0.3转录子/CFU结核分枝杆菌下降到0.02转录子/CFU，且这一低水平在感染后持续至少达100天。因此在感染后2周的任何时间点，少于2%的细菌积极地表达Ag85B（同前）。Ag85B的低表达由以下支持：感染后3周或之后肺中能够响应于Ag85B产生IFN-g的T细胞数目快速下降。相反，一些抗原贯穿不同感染阶段更稳定地（组成型）表达，一个实例是ESAT6。在最初感染阶段后，ESAT-6表达水平稳定在0.8转录子/CFU结核分枝杆菌。这是比Ag85B高得多的转录水平，这一水平稳定地保持达感染后至少100天（Rogerson,BJ等2006）。再一次地，转录数据被免疫数据支持，免疫数据显示在感染后期阶段在感染部位，T细胞对ESAT-6的强的识别（同前）。这一组成型表达模式是个重要特征，说明这些分子实现对于病原体至关重要的必需功能，这些功能依赖于需要组成型表达以使病原体在免疫宿主中存活的基因。这些分子是本专利技术的基础，对于向潜伏感染个体施用的疫苗是尤其重要的抗原，因为它们靶向细菌生命周期的所有阶段，因而具有尽可能宽的活性基础。这与集中于鉴定在非复制持续期间被分枝杆菌上调的抗原的现有思路不同（Andersen,P.2007、WO02048391、WO04006952、LinMY和OttenhoffTH2008；LeytenEM.等2006）。尽管这些抗原在非复制持续期间被上调，它们可能不总是免疫识别可获得的，因为从非复制细菌可获得的量低于检测或触发保护性免疫效应功能的合理阈值。相反，来自ESX-1分泌系统的多种蛋白已经显示为高度免疫原性和以高水平表达。ESX-1在多种病原性分枝杆菌中是保守的，并参与结核杆菌（tuberclebacilli）的毒性。个体ESX-1蛋白在分泌ESAT-6、CFP10和EspA中的贡献已被充分记载（PymAS等2003；GuinnKI等,2004；Stanley,SA等2003；Brodin,P.等2006；MacGurnJA等2005；Raghavan,S.等2008），效应分子的功能已显示为膜裂解，从吞噬体逃逸和细菌扩散（GaoLY等2004；SmithJ.等2008）。控制潜伏性感染的免疫应答的所有特性和引起再活化的因素基本上是未知的。然而，有一些证据证明与主导细胞类型的转变有关。虽然CD4T细胞对急性期的感染控制是必要的和足够的，但研究揭示CD8T细胞反应在潜伏期更为重要（vanPinxterenLA等.2000）。本领域的技术人员将会容易地理解，一种基因的表达不足以使其成为一种好的候选疫苗。确定一种蛋白在结核分枝杆菌潜伏感染期间是否被免疫系统识别的唯一方法是制备出这种给定的蛋白，并按照这里描述的适当试验对该蛋白进行测试。在这方面，我们的研究组已经证实，被分枝杆菌强表达的抗原诸如ESAT-6（早期分泌抗原靶-6）在所有感染阶段个体中被识别，事实上尤其在潜伏感染个体中被识别（Boesen,Ravn,Doherty2002）。然而在自然感染期间引发的ESAT-6特异性T细胞虽然可能大量存在，但作为抵抗传染病的保护性T细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疫苗，所述疫苗施用于潜伏感染个体，预防结核病的再激活，所述疫苗包含在结核分枝杆菌（M.tuberculosis）感染期间组成型表达的抗原或编码所述抗原的核酸，其中所述抗原是：i)SEQ ID NO.4或ii)SEQ ID NO.4的T细胞表位。

【技术特征摘要】
2009.04.24 DK PA2009005391.一种疫苗，所述疫苗施用于无活跃结核病体征的潜伏感染个体，预防结核病的再激活，所述疫苗包含在结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染期间组成型表达的抗原或编码所述抗原的核酸，其中所述抗原是：i)SEQIDNO.4或ii)SEQIDNO.4的T细胞表位。2.如权利要求1所述的疫苗，其中所述抗原与分枝杆菌科的细菌组成型表达的抗原融合。3.如权利要求2所述的疫苗，所述疫苗包含与CFP10融合的ESAT6。4.如权利要求1-3任一项所述的疫苗，所述疫苗包含递送系统。5.如权利要求4所述的疫苗，其中所述递送系统是佐剂。6.如权利要求5所述的疫苗，其中所述佐剂包含DDA/TDB和/或聚I:C。7.如权利要求1-3任一项所述的疫苗，其中所述氨基酸序列被脂化以允许所述多肽的自佐剂作用。8.如权利要求4所述的疫苗，其中所述氨基酸序列被脂化以允许所述多肽的自佐剂作用。9.如权利要求5所述的疫苗，其中所述氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·迪特里希，彼得·安德森，卡里纳·温斯波·伦德贝里，特吕克·蒂·吉姆·坦·候昂，
申请(专利权)人：国立血清研究所，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK