本发明专利技术属于细胞工程技术领域。具体涉及一种花曲柳(Fraxinus rhynchophylla Hance.)愈伤组织团块悬浮培养体系的建立方法。本发明专利技术以优良花曲柳茎段和叶片作为原始材料，在添加了激素NAA和TDZ的WPM固体培养基上诱导出愈伤组织，将愈伤组织接种到添加了激素NAA和TDZ的WPM液体培养基中，光照振荡培养。经过多代定向诱导驯化，建立了生长量稳定，增殖迅速，团块均匀的愈伤组织团块悬浮系。本发明专利技术具有方法简单易行，操作性强，增殖系数可观，能够促进花曲柳的快速繁殖的特点。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于细胞工程
。具体涉及一种花曲柳(Fraxinus?rhynchophylla?Hance.)愈伤组织团块悬浮培养体系的建立方法。本专利技术以优良花曲柳茎段和叶片作为原始材料，在添加了激素NAA和TDZ的WPM固体培养基上诱导出愈伤组织，将愈伤组织接种到添加了激素NAA和TDZ的WPM液体培养基中，光照振荡培养。经过多代定向诱导驯化，建立了生长量稳定，增殖迅速，团块均匀的愈伤组织团块悬浮系。本专利技术具有方法简单易行，操作性强，增殖系数可观，能够促进花曲柳的快速繁殖的特点。【专利说明】花曲柳悬淳培养体系的建立方法
一种利用基本培养基和附加激素建立花曲柳悬浮培养体系的方法，本专利技术隶属植 物细胞工程的
。
技术介绍
花曲柳（Fraxinus rhynchophylla Hance.)属于木犀科禅属落叶大乔木，又称大 叶白蜡、苦枥白蜡树。干燥树皮、枝皮为我国的传统中药材"秦皮"的四种入药皮料之一， 具有清热燥湿、明目和止咳平喘的作用。近年来的分析化学研究表明，其树皮中含有多种 香豆素类成分，如秦皮甲素（Esculin)，秦皮乙素（Esculetin)，秦皮苷（Fraxin)，秦皮素 (Fraxetol)等。花曲柳干燥枝皮、干皮具有清热燥湿，明目，收涩的功效。现代药理学研究 表明，其皮兼有抗菌、消炎、利尿、止咳平喘、镇静、祛痰等作用。近年来，有学者研究发现，香 豆素类成分具有抗肿瘤、抗HIV以及免疫调节的重要作用。这使得香豆素类物质的价值越 来越多地得以体现。目前常用药用香豆素类化合物主要来自于木犀科白蜡属植物，在入药 的秦皮来源中，花曲柳树皮的香豆素总量含量最多。这使得白蜡属树木资源遭到了破坏，而 树木的再生周期较长，树皮再生慢，且易受病虫害侵害，环剥将造成树木死亡，长此以往，白 蜡属树木资源会趋于枯竭，违背了科学发展观的可持续发展思想。利用植物细胞工程手段， 培养大量悬浮细胞并分离其次生代谢产物，提高花曲柳悬浮培养体系中香豆素类物质的含 量，且不受季节限制，这将对花曲柳香豆素类药用成分生产和临床应用及花曲柳物种的保 护起到积极的推动作用。 以花曲柳悬浮培养愈伤组织团块进行细胞工程、基因工程等研究有明显优势，原 因之一是愈伤组织团块取材少，生长速度快，组织形成稳定结构，次生代谢产物产量高，受 其他细胞和微环境影响不大，遗传学上也比较稳定；其次是愈伤组织团块继代周期短，增殖 速度快，通过再分化手段对再生植株进行选择培养，也可以缩短育种年限，对保护物种有重 要意义。目前，花曲柳愈伤组织培养研究外植体材料来源主要为休眠芽萌发茎段、无菌种子 萌发的茎段。愈伤组织诱导植株再生及悬浮培养体系的建立尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术目的是建立一种花曲柳悬浮培养体系的方法，该法简单易行，操作性强，增 殖系数可观，能够促进花曲柳的快速繁殖。 为达到上述目的，本专利技术采用以下技术措施： 步骤一，以花曲柳的茎段和叶片作为外植体，首先用75%酒精浸泡25-30s，然后用 饱和Ca (C10) 2水溶液处理8?12min，最后用无菌水冲洗4-6次； 步骤二，将消毒好的茎段（或叶片）在培养皿中用无菌刀切割成0.5-lcm(或 cm2)左右的小段（或块），接种于固体WPM基本培养基附加 NAA(a_naphthalene acetic acid) 1· 2-1. 8mg/L、TDZ (thidiazuron) 0· 05-0. lmg/L、鹿糖 20g/L、琼脂 5. 3g/L、ρΗ6· 0 ? 6. 5〇 步骤三，光照培养，温度23?26°C，每天光照16h，培养30d ; 步骤四，将诱导出的愈伤组织用无菌刀切成0. 5-lcm2,接种到含有约50mL液体培 养基的100mL的三角瓶中，每瓶接种愈伤组织30-50块，置于转速为110-140r/min的摇床 上，温度23-26°C，每天光照16h，培养7-14d继代一次。培养基使用1/2WPM基本培养基附 加 NAA(a_naphthalene acetic acid) 0.7-1. 4mg/L、TDZ(thidiazuron) 0.03-0. 07mg/L、鹿 糖 20g/L、pH6. 0 ?6. 5。 本专利技术的优点是：利用花曲柳茎段诱导形成的愈伤组织，诱导率达到100%，进一 步建立愈伤组织团块悬浮培养体系，每14天增殖3-5倍，愈伤组织紧密，干物质含量高，有 利于次生代谢产物的积累，本专利技术建立的悬浮体系可用于生物反应器培养和扩大生产。 本专利技术方法简单易行，操作性强，增殖系数可观，能够促进花曲柳的快速繁殖。。 【专利附图】【附图说明】：悬浮培养7d的花曲柳愈伤组织。 【专利附图】【附图说明】 图1花曲柳悬浮细胞侧面观察图 图2花曲柳悬浮细胞底部观察图 【具体实施方式】： 一种水曲柳悬浮培养体系的建立方法，其具体步骤如下： 步骤一，以花曲柳茎段和叶片作为外植体，用75%酒精浸泡25s或28s或30s，用饱 和Ca(C10) 2水溶液处理8min或lOmin或12min，用无菌水冲洗4次或5次或6次； 步骤二，将消毒好的茎段和叶片在培养皿中用无菌刀切割成0.5-lcm(cm2)左右 的小段（块），接种在固体启动培养基上，WPM培养基附加 NAA (a-naphthalene acetic acid) 1· 2-1. 8mg/L、TDZ (thidiazuron) 0· 05-0. lmg/L、鹿糖 20g/L、琼脂 5. 3g/L、ρΗ6· 0 ? 6. 5 ； 步骤三，待愈伤组织长到1cm?2cm3,转到继代培养基WPM培养基附加 NAA1. Omg/ L、TDZ(thidiazuron)0· lmg/L、鹿糖 20g/L、琼脂 5. 3g/L、ρΗ6· 0 ?6· 5 ;每天光照 16h，温度 23°C ?26°C，培养 30d ; 步骤四，将愈伤组织用无菌刀切成0. 5?1cm(或cm2)左右的小段（或块），接种到 含有50mL液体培养基的100mL的三角瓶中，每瓶接种愈伤组织3g，，置于转速为110-140r/ min的摇床上，温度23°C?26°C，每天光照16h，培养7-14d继代一次。悬浮培养基为1/2WPM 基本培养基附加 ΝΑΑ0. 7-1. 4mg/L、TDZ0. 03-0. 07mg/L、蔗糖 20g/L、ρΗ6· 0-6. 5。 步骤五，继代培养3-5次后，即可获得稳定悬浮培养系，每代增殖3-5倍。【权利要求】1. 一种花曲柳（Fraxinus rhynchophylla Hance.)愈伤组织团块悬浮体系建立的方 法，其特征在于它包括如下步骤： (1) 外植体制备 材料消毒：在超净工作台上将取下的花曲柳茎段和叶片在75%酒精浸泡25-30s，无菌 水冲洗2次，每次5分钟，置入饱和Ca (C10) 2水溶液处理8-12min，用无菌水冲洗4-6次，每 次5分钟，无菌滤纸上吸干； (2) 愈伤组织诱导 将（1)处理好的花曲柳茎段（或叶片）切割成〇· 5-lcm(或cm2)左右的小段（或块）， 接入诱导愈伤组织培养基中诱导愈伤组织； (3) 悬浮培养体系建立 将（2)获得的愈伤组织切割成0本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种花曲柳(Fraxinus rhynchophylla Hance.)愈伤组织团块悬浮体系建立的方法，其特征在于它包括如下步骤： （1）外植体制备 材料消毒：在超净工作台上将取下的花曲柳茎段和叶片在75%酒精浸泡25‑30s，无菌水冲洗2次，每次5分钟，置入饱和Ca(ClO)2水溶液处理8‑12min，用无菌水冲洗4‑6次，每次5分钟，无菌滤纸上吸干； （2）愈伤组织诱导 将（1）处理好的花曲柳茎段(或叶片)切割成0.5‑1cm(或cm2)左右的小段(或块)，接入诱导愈伤组织培养基中诱导愈伤组织； （3）悬浮培养体系建立 将（2）获得的愈伤组织切割成0.5‑1cm3，接种到适合悬浮细胞生长的液体培养基中，置于转速为110‑140r/min的摇床上，温度23‑26℃，每天光照16h，培养7‑14d继代一次。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：詹亚光，刘孚婧，齐凤慧，尹静，曾凡锁，范桂枝，
申请(专利权)人：东北林业大学，詹亚光，刘孚婧，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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