一株产多不饱和脂肪酸的菌株及其筛选方法技术

本发明专利技术公开了一株产多不饱和脂肪酸(PUFAs)的菌株及其筛选方法，所述菌株分类学命名为卷枝毛霉(Mucor circinelloides)，保藏编号为：CGMCC No.8361；所述筛选方法包括以下步骤：(1)低温初筛；(2)苏丹黑染色复筛；(3)液体发酵培养和(4)气相色谱检测菌株胞内脂肪酸含量。本发明专利技术得到的菌株可高产多不饱和脂肪酸；利用本发明专利技术的筛选方法能够快速、重复获得该菌株，具有成本低廉、可应用于产业化生产等优点。

【技术实现步骤摘要】
一株产多不饱和脂肪酸的菌株及其筛选方法
本专利技术涉及微生物领域，具体涉及一株菌株及其筛选方法，尤其涉及一株产多不饱和脂肪酸的菌株及其筛选方法。
技术介绍
多不饱和脂肪酸(PUFAs)是指含有两个或两个以上碳-碳双键且碳原子数为16-22的直链脂肪酸。根据第一个双键在碳链中所处的位置，PUFAs可分为ω-3、ω-6和ω-9等系列，但具有重要生物学意义的是ω-3和ω-6PUFAs。ω-3PUFAs主要包括α-亚麻酸(ALA)，十八碳四烯酸，二十碳四烯酸，二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳五烯酸(DPA)以及二十二碳六烯酸(DHA)。ω-6PUFAs主要包括亚油酸(LA)，γ－亚麻酸(GLA)，双高γ－亚麻酸(DGLA)以及花生四烯酸(AA)。研究表明PUFAs对人体有众多保健功能：PUFAs能够显著改变脂蛋白代谢，从而降低心血管疾病的发病率；具有抗炎症、抗肿瘤及治疗精神分裂等功能；PUFAs通过改变脂类代谢而降低动脉粥样硬化的发病率，还具有免疫调节和美容等功能。人和动物能自行合成所需的饱和脂肪酸及部分单不饱和脂肪酸，但无法合成PUFAs。所以必须从膳食中摄入LA、GLA，然后在体内转化为其他长链PUFAs。但随着年龄的增加，这种转化能力急剧衰弱，因此成年人需要从膳食中补充几乎所有的PUFAs。目前LA、GLA主要来源于植物种子，但受气候和地域的限制，并且植物资源易受农药污染的威胁，20碳以上的长链PUFAs主要来自深海鱼油，但是这种PUFAs风味较差，而且海洋污染、鱼类资源枯竭等问题的加重也导致鱼油来源的功能油脂无法满足市场要求。因此，成本低廉，易规模化、产业化生产的微生物发酵法生产PUFAs有着广阔的市场前景。获得具有自主知识产权的功能油脂生产用菌有着重要的应用价值和经济效益。国内外研究者对产PUFAs的菌种筛选研究表明，来自高纬度土样中的霉菌，尤其是被孢霉属的一些丝状真菌，合成长链多不饱和脂肪酸的应用潜力比较大。许本波等人，以深黄被孢霉(MortierellaisabellinaAs3.3410)为出发菌株，经微波诱变和紫外诱变，乙酰水杨酸与低温(15℃)相结合的筛选方法，获得1株高产多不饱和脂肪酸菌株A35-4(高产PUFAs深黄被孢霉菌株的筛选，许本波等，遗传，2011，30(10)：1147-1152)。李三暑采用二联吡啶作为诱变剂，诱导被孢霉属菌株L8突变，筛选高产不饱和脂肪酸的突变株L83，经过培养基和培养条件的调整，进一步提高碘值到102.3，提高了27.56％(被孢霉菌株L8诱变及其发酵条件的研究，江西农业大学学报，2000,22(3)：434-438)。吕晴等采用气相色谱-质谱对采自云南白马雪山土壤中并经分离和发酵培养的被孢霉菌株SM96的菌丝体油脂中脂肪酸组成进行了定性分析和峰面积相对含量测定，共检测出30种脂肪酸，其中多不饱和脂肪酸含量为62.4％(被孢霉菌丝体脂肪酸组成的气相色谱-质谱分析，吕晴等，2003，22(2)：22-24)。除了利用被孢菌属的菌株外，还有利用工程化的含油酵母解脂耶氏酵母菌株生产多不饱和脂肪酸，例如CN101437952A、CN101437951A和CN102803289A。CN101591617A公开了一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法和应用，其利用紫外化学诱变筛选方法得到的菌株分类命名为隐甲藻(Cypthecodiniumcohnii)。目前现有技术中通常采用诱变筛选而获得产多不饱和脂肪酸的菌株，存在变异大，无法实现产业化生产的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株菌株及其筛选方法，特别是一株高产多不饱和脂肪酸的菌株及其筛选方法。为达到此专利技术的目的，本专利技术采用以下技术方案：在第一方面，本专利技术提供了一株产不饱和脂肪酸的菌株，其分类学命名为卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学微生物研究所，保藏日期为2013年10月17日，保藏编号为CGMCCNo.8361。本专利技术所提供的产不饱和脂肪酸(PUFAs)菌株(Mucorcircinelloides)的菌落形态为：培养初期(1-2天)菌落呈白色，气生菌丝生长旺盛并较长，培养2天后有黑色孢子附着在气生菌丝上，培养3-5天菌株菌落青黑色，蔓延至整个斜面，疏松平展。在第二方面，本专利技术提供了如第一方面所述的产不饱和脂肪酸菌株的筛选方法，所述方法包括以下步骤：(1)低温初筛：将土壤样品的稀释液涂布于平板上，低温下培养；(2)苏丹黑染色复筛：将低温培养平板上长出的菌落挑出，用苏丹黑染液进行染色制片，镜检；(3)液体发酵培养：将复筛得到的菌株进行种子培养和发酵培养，收集并干燥菌体；(4)气相色谱检测：提取上述干燥菌体中的胞内脂肪酸，气相色谱检测其含量。步骤(1)所述平板培养基为PDA培养基；所述PDA培养基含有如下组分：马铃薯200g/L；葡萄糖20g/L；琼脂17g/L；将培养基pH值调至5.8，115℃灭菌20min。优选地，所述的低温培养在3-10℃下进行，培养5-9天。本专利技术采用5℃低温条件下培养，微生物生长很慢，而且其中大多是湿润的细菌菌落，少数的丝状真菌菌落；采用该低温条件培养抑制了很多微生物的生长，而能合成较高PUFAs的菌株则生存下来。步骤(2)所述的筛选方法中苏丹黑染液由苏丹黑B保存液40mL加碳酸磷酸缓冲液20mL混合过滤而成。优选地，所述苏丹黑B保存液的配制为：苏丹黑B0.15g加50mL无水乙醇混匀，放置2天，时常摇动，使苏丹黑B完全溶解。优选地，所述的碳酸磷酸缓冲液由a、b两种溶液混合而成；a溶液的配制为：石碳酸结晶8g加无水乙醇15mL，混匀；b溶液的配制为：十二水合磷酸氢二钠0.15g加蒸馏水50mL，混匀。步骤(2)所述的筛选方法中，选用光学显微镜进行镜检，物镜为40×，目镜为10×。步骤(3)所述的液体发酵培养条件为：温度30℃，转速150rpm，培养5天。所述的种子培养为：将筛选得到的菌株接种到装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，150r/min摇床培养3天，作为发酵用菌种。所述的发酵培养为：利用分散剂打散发酵用菌体后，按10％的接种量接种到装有1L带挡板的锥形瓶中，30℃，150r/min摇床培养120h。优选地，所述的种子培养基组成为：葡萄糖30g/L；酵母粉1.5g/L；L-酒石酸铵3.3g/L；磷酸二氢钾7.0g/L；磷酸氢二钠2.0g/L；七水硫酸镁1.5g/L；二水氯化钙0.1g/L；六水合三氯化铁0.008g/L；七水硫酸锌0.001g/L；五水硫酸铜0.0001g/L；六水硝酸钴0.0001g/L；五水硫酸锰0.0001g/L；并用氢氧化钾调pH至6.2，葡萄糖分开灭菌，115℃灭菌20min。优选地，所述的发酵培养基组成为：葡萄糖50g/L；酵母粉1.5g/L；L-酒石酸铵2.0g/L；磷酸二氢钾7.0g/L；磷酸氢二钠2.0g/L；七水硫酸镁1.5g/L；二水氯化钙0.1g/L；六水合三氯化铁0.008g/L；七水硫酸锌0.001g/L；五水硫酸铜0.0001g/L；六水硝酸钴0.0001g/L；五水硫酸锰0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株产多不饱和脂肪酸(PUFAs)的菌株，其分类学命名为卷枝毛霉(Mucor circinelloides)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2013年10月17日，保藏编号为CGMCC No.8361。

【技术特征摘要】
1.一株产多不饱和脂肪酸(PUFAs)的菌株，其分类学命名为卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)，保藏于中国...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小鸣，熊文珂，蒋瑜，王萍，李敏，江丽红，
申请(专利权)人：无锡超科食品有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32