实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法技术

本发明专利技术属核酸检测领域，涉及一种实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法；该方法基于CA6VP1序列设计了特异性的引物和Taqman探针，用于快速、特异和高灵敏度地检测CA6病毒，本发明专利技术方法能稳定和有效地扩增CA6基因片段，最高检测灵敏度能达到10copies/μl；且该方法的特异性高，未观察到假阳性的结果；本发明专利技术方法检测CA6快速，灵敏，可靠。可进一步用于大规模标本的实验室检测，及用于CA6的流行病学的监测工作，有助于临床实践中的早期快速诊断。

【技术实现步骤摘要】
实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法
本专利技术属检测领域，涉及核酸检测方法，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法。
技术介绍
现有技术公开了手足口病（hand，footandmouthdisease，HFMD）是由人肠道病毒(humanenterovirus，HEV)引起的常见传染病；有统计显示，该病一年四季均可发病，5～7月为高发期，5岁以下儿童多见，其中的大多数临床症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主，少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹（AFP）、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。自1997年至今，在马来西亚，新加坡，澳大利亚，中国等多个国家已经有数次HFMD暴发流行；HFMD已经成为亚太地区严重的公共卫生问题并引起多个国家的关注。尽管引起HFMD的主要病原是EV71和CA16，但是近年来多个国家报道了以CA6为主要病原导致的HFMD暴发流行；2008年秋冬季，芬兰报道了以脱甲病为主要临床表现的HFMD的暴发，主要病原是CA6；同样，从2009至2011年在台湾，日本和新加坡等地区相继暴发了以CA6为主要病原的HFMD。在2012年冬季中国上海地区对肠道病毒监测中，发现了CA6取代了EV71为导致HFMD的主要肠道病毒。上述统计结果表明，CA6有可能成为新发的HFMD暴发流行的主要病原，因此，在HFMD的防控工作中，对于CA6的日常监测显得非常必要。传统的HEV鉴定分型主要基于病毒分离和抗血清中和实验；但该方法鉴定周期长且抗血清容易和其他HEV产生交叉反应，随着分子生物学的发展，基于病毒核苷酸序列分析的分型方法越来越多地被应用。Nix等人研究的snPCR方法，结合sanger测序的方法可快速灵敏用于HEV分型鉴定。上述分子分型方法虽可对HEV分型鉴定，但通常需要测序和序列比对来确定病原，尤其在HEV暴发流行时，所述方法往往不适用于临床大规模标本中病原检测。迄今为止，世界范围内已经有数次CA6导致的HFMD暴发，但用于CA6特异性检测快速灵敏的方法尚鲜见有报道，尤其是未见有关特异性实时荧光定量PCR（real-timePCR）检测CA6病毒的方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供用于CA6特异性检测快速灵敏的方法，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法。本专利技术方法基于CA6VP1序列设计了特异性的引物和Taqman探针，可用于快速、特异和高灵敏度地检测疑似患者标本，进一步为HFMD的临床诊断和治疗及疫情防控提供参考依据。具体的，本专利技术的实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法，其特征在于，其包括步骤：（1）临床采集标本收集手足口病患者的咽拭子、粪便标本；（2）设计引物根据Genbank库中收录的CA6的衣壳蛋白（VP1）编码序列并结合CA6流行地区的VP1序列，本专利技术的实施例中采用上海地区CA6流行的VP1序列，采用PrimerExpress3.0设计合成CA6特异性real-timePCR的引物和探针；采用NCBI网站上的BLAST工具盒BioEdit软件（version7.0.9）分析所设计的引物和探针的保守性；所述引物和探针由上海Invitrogen公司合成；（3）提取核酸，Real-timePCR和T-A克隆采用HighPureViralNucleicAcidKit（Roche11858874001）提取病毒基因组RNA；将样本加入含poly(A)的BindingBuffer中，再加入蛋白酶K混匀，72℃裂解10min，用柱子吸附RNA，加入InhibitorRemovalBuffer洗1次；再用WashBuffer洗2次，最后用50µlElutionBuffer洗脱RNA；PCR采用试剂盒（TakaraDRR064A）进行，反应液中包含2×BufferMix12.5μl,TaKaRaExTaqHS（5U/μl）0.5μl,PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μl,上游引物CA6F10pmol,下游引物CA6R10pmol，探针3pmol,RNA模板2.5μl；其中，PCR反应条件：42℃反转录，10min；95℃10s，60℃40s，运行45个循环，在60℃进行荧光采集；反应在实时荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems,ViiA™7系统）上进行，本专利技术所涉及的引物和探针序列如表1所示，表1引物和探针序列*参考的CA6病毒株为TW/399/10（GenbankNo.JQ946054）；取一份Real-timeRT-PCR阳性产物25μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳；采用割胶纯化试剂盒（Invitrogen,K2100-12）回收107bp大小的PCR产物，通过T-A克隆试剂盒（Takara，D101A）将PCR产物克隆进pMD18-T载体；通过测序获得克隆片段序列，然后使用BLAST工具对克隆片段进行比对分析；（4）评估Real-timeRT-PCR的灵敏度和特异性评估该PCR方法的灵敏度,采用T-A克隆质粒制作标准品进行Standardcurve实验的方法；首先微量紫外分光光度计（Thermo，NanoDropND-2000C）对克隆质粒进行核酸定量，然后进行10倍模板稀释，制作107～102copies/μl的标准品；以所述标准品为模板进行Real-timeRT-PCR，获得Standardcurve；选取18种HEV血清型（包括EV71，EV68，CVA2，CVA4，CVA5，CVA10，CVA12，CVA21，CVB1，CVB2，CVB4，CVB5，Echo3,Echo9,Echo19,Echo25,Echo30）验证该PCR方法的特异性：首先采用HighPureViralNucleicAcidKit（Roche11858874001）提取上述病毒株的基因组RNA，再以上述基因组RNA为模板并选择克隆质粒为阳性对照品进行real-timeRT-PCR，观察扩增曲线；（5）Real-timeRT-PCR检测临床标本对上述手足口病例标本，进行核酸提取；然后参考中国卫生部颁布的《手足口病预防控制指南（2009版）》，采用指南中推荐的RT-PCR进行肠道病毒属特异性筛选；筛选出的肠道病毒阳性标本再采用RT-PCR的方法进行EV71和CA16的筛选；肠道病毒属检测阳性而EV71和CA16检测阴性的标本，采用新建立的Real-timeRT-PCR方法检测CA6，同时，采用RT-snPCR方法对上述标本进行平行检测分型，验证新荧光定量PCR方法的准确性。本专利技术中，通过灵敏度和特异性实验，结果显示，所述的实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法，能稳定和有效地扩增CA6基因片段，最高检测灵敏度能达到10copies/μl；且该方法的特异性高，未观察到假阳性的结果；表明本专利技术所述的方法检测CA6快速，灵敏，可靠。本方法可进一步用于大规模标本的实验室检测，及用于CA6的流行病学的监测工作，有助于临床实践中的早期快速诊断。附图说明图1显示了Bioedit分析引物和探针序列的保守性，其中，A：上游引物CA6F和26株来自于2008年至2012年芬兰、西班牙、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种实时荧光定量PCR检测CA6病毒的方法，其特征在于，其包括步骤：（1）采集标本收集手足口病患者的咽拭子、粪便标本；（2）设计引物根据Genbank库中收录的CA6的衣壳蛋白VP1编码序列并结合CA6流行地区的VP1序列，设计合成CA6特异性real‑time PCR的引物和探针，然后分析上述述引物和探针的保守性；（3）提取核酸，Real‑time PCR和T‑A克隆提取病毒基因组RNA；将样本加入含poly(A)的Binding Buffer中，再加入蛋白酶K混匀，72 ℃裂解，用柱子吸附RNA，加入Inhibitor Removal Buffer洗1次；再用Wash Buffer洗2次，最后用Elution Buffer洗脱RNA；PCR采用试剂盒（Takara DRR064A）进行，25μl反应液中包含2× Buffer Mix12.5μl, TaKaRa Ex Taq HS（5 U/ μl）0.5μl, PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μl, 上游引物CA6F 10pmol,下游引物CA6R 10pmol，探针3pmol,RNA模板2.5μl；其中，PCR反应条件：42℃反转录，10min；95℃10s，60℃40s，运行45个循环，在60℃进行荧光采集；反应在实时荧光定量PCR仪上进行，引物和探针序列为，*参考的CA6病毒株为TW/399/10（Genbank No. JQ946054）；取Real‑time RT‑PCR阳性产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳；采用割胶纯化试剂盒回收107bp 大小的PCR产物，通过T‑A克隆试剂盒将PCR产物克隆进pMD18‑T载体；通过测序获得克隆片段序列，然后用BLAST工具对克隆片段进行比对分析；（4）评估Real‑time RT‑PCR的灵敏度和特异性采用T‑A克隆质粒制作标准品进行Standard curve实验的方法：首先微量紫外分光光度计对克隆质粒进行核酸定量，然后进行10倍模板稀释，制作107～102copies/μl的标准品；以所述标准品为模板进行Real‑time RT‑PCR，获得Standard curve；选取18种HEV血清型，包括EV71，EV68，CVA2，CVA4，CVA5，CVA10，CVA12，CVA21，CVB1，CVB2，CVB4，CVB5，Echo 3, Echo 9, Echo 19, Echo 25, Echo 30验证该PCR方法的特异性：首先采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit提取上述病毒株的基因组RNA，再以上述基因组RNA为模板并选择克隆质粒为阳性对照品进行real‑time RT‑PCR，观察扩增曲线；（5）Real‑time RT‑PCR检测临床标本 对采集的标本，进行核酸提取；然后采用RT‑PCR进行肠道病毒属特异性筛选；筛选出的肠道病毒阳性标本再采用RT‑PCR的方法进行EV71和CA16的筛选；肠道病毒属检测阳性而EV71和CA16检测阴性的标本，采用Real‑time RT‑PCR方法检测CA6，同时，采用RT‑snPCR方法对上述标本进行平行检测分型，验证新荧光定量PCR方法的准确性。...

【技术特征摘要】
1.实时荧光定量PCR检测CA6病毒的引物和探针，其特征在于，其序列为，CA6F：CAAGCYGCAGAAACGGGAGC，CA6R：GAAGTGYTCCACACTCGCCTC，CA6P：FAM-CCGTTTCGATTCATCACACARCGAGT-BHQ1。2.权利要求1的实时荧光定量PCR检测CA6病毒的引物和探针在制备CA6病毒检测试剂中的用途。3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，检测CA6病毒的方法中包括步骤：（1）采集标本收集获得手足口病患者离体的咽拭子、粪便标本；（2）设计引物根据Genbank库中收录的CA6的衣壳蛋白VP1编码序列并结合CA6流行地区的VP1序列，设计合成CA6特异性real-timePCR的引物和探针，然后分析上述引物和探针的保守性；（3）提取核酸，Real-timePCR和T-A克隆提取病毒基因组RNA；将样本加入含polyA的BindingBuffer中，再加入蛋白酶K混匀，72℃裂解，用柱子吸附RNA，加入InhibitorRemovalBuffer洗1次；再用WashBuffer洗2次，最后用ElutionBuffer洗脱RNA；PCR采用试剂盒进行，25μl反应液中包含2×BufferMix12.5μl,TaKaRaExTaqHS0.5μl,PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μl,上游引物CA6F10pmol,下游引物CA6R10pmol，探针3pmol,RNA模板2.5μl；其中，PCR反应条件：42℃反转录，10min；95℃10s，60℃40s，运行45个循环，在60℃进行荧光采集；反应在实时荧光定量PCR仪上进行，引物和探针序列为，*参考的CA6病毒株为TW/399/10；取Real-timeRT-PCR阳性产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳；采用割胶纯化试剂盒回收PCR产物，通过T-A克隆试剂盒将PCR产物克隆进pMD18-T载体；通过测序获得克隆片段序列，然后用BLAST工具对克隆片段进行比对分析；（4）评估Real-timeRT-PCR的灵敏度和特异性采用T-A克隆质粒制作标准品进行Standardcurve实验的方法：首先微量紫外分光光度计对克隆质粒进行核酸定量，然后进行10倍模板稀释，制作107～102copies/μl的标准品；以所述标准品为模板进行Real...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡芸文，管文彩，张晓玲，宋志刚，
申请(专利权)人：上海市公共卫生临床中心，
类型：发明
国别省市：上海;31