一种利用酵母突变株检测纳米材料细胞毒性的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用酵母突变株快速检测纳米材料细胞毒性的方法，其步骤：A、酵母特异基因的敲除：①提取酿酒酵母基因组；②构建基因敲除组件；③醋酸锂转化法将基因敲除组件转入酵母细胞；④筛选得到基因敲除酵母；B、纳米材料悬浮液配置；C、酵母受试纳米材料；D、酵母受试后细胞浓度检测；E、结果计算和分析：扣除空白，计算生长抑制率/细胞活力；F、根据纳米材料对酵母生长抑制率大小，得出纳米材料对酵母菌的半数效应浓度EC50，进而判定纳米材料毒性大小。方法易行，操作简便，检测速度快，灵敏度高，价格低廉，适用范围广，可以用于检测不同水溶液中纳米材料对生物的细胞毒性。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种利用酵母突变株检测纳米材料细胞毒性的方法，其步骤是：A、cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除酵母菌株及yap1cwp1cwp2pdr5snq2五基因敲除酵母菌株的构建：①提取酿酒酵母基因组：酵母基因组提取方法，接种酵母到酵母YPD培养基中，30℃，培养16～18 h；离心收集菌体；菌体用SCE：1mol/L 山梨醇、10mmol/L 柠檬酸钠、10mmol/L EDTA、10mmol/L二硫苏糖醇溶液重悬，加入10mg/ml溶菌酶，37℃温浴1 h；再加入2%w/vSDS混匀，‑20℃冰冻，然后室温震荡溶解，反复3次；向悬浮液中加入5mol/L 醋酸钾：pH=8.9混匀，离心5min；将上清转移到离心管中，加入2倍体积的乙醇，混匀，室温放置5min后离心10min；除去上清，将沉淀溶解在300μl TE中，加入RNA酶，37℃温浴30min；加入饱和酚及氯仿，混匀，离心5min；转移上清到离心管中，加入1/2体积的7.5mol/L 醋酸铵和等体积的异丙醇，‑20℃放置20min后离心10min；除去上清，加入70%v/v乙醇漂洗沉淀一次，离心5min；风干除去乙醇，用TE溶解酵母DNA；②构建cwp1△：：HisGURA3‑hisG基因敲除组件；将含有Xho1内切酶位点的上游引物CWP1‑1和含有Sph1内切酶位点的下游引物CWP1‑2以酵母细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到CWP1基因，将cwp1基因与hisG‑URA3‑hisG片段连接，得到cwp1△：：HisGURA3‑hisG基因敲除组件；③构建cwp2△：：His3基因敲除组件；将含有EcoR1内切酶位点的上游引物CWP2‑1和含有Sph1内切酶位点的下游引物CWP2‑2以酵母细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到0.5kbCWP2基因BcoRT‑BamHT序列；将含有BamⅢ内切酶位点的上游引物CWP2‑3和含有Sph1内切酶位点的下游引物CWP2‑4以酵母细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到0.3kbCWP2基因BamⅢ‑Sph1序列，将cwp2基因与his3片段连接，得到cwp2△：：His3基因敲除组件;④构建pdr5△：LEU2基因敲除组件；将含有BgⅢ内切酶位点的上游引物CWP2‑1和含有Sph1内切酶位点的下游引物CWP2‑2以酵母细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到1.5kbPDR5基因，将PDR5基因与LEU2片段连接，得到pdr5△：LEU2基因敲除组件;⑤将cwp1△：：HisGURA3‑hisG、cwp2△：：His3、pdr5△：LEU2基因敲除组件转入snq2单基因敲除酵母，筛选得到cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除酵母；⑥五基因敲除酵母是在四基因敲除酵母的基础上构建：a、yap1△：：His3基因敲除组件：通过上游引物YAP1‑1和含有Sph1内切酶位点的下游引物YAP1‑2以酵母细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到2.5kbYAP1基因，将YAP1基因与His3片段连接，得到yap1△：：His3基因敲除组件;b、将yap1△：：His3基因敲除组件转入cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除酵母，筛选得到yap1cwp1cwp2pdr5snq2五基因敲除酵母；B、纳米CuO溶液的配制：用分析天平称取1.000g纳米CuO：r=20nm，纯度：99.9%，于1L去离子水中，纳米CuO的母液浓度为1 g/L，超声分散20 min，4℃避光保存，用前涡旋；C、细胞毒性实验：接种野生型酵母BY4741、cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除酵母和yap1cwp1cwp2pdr5snq2五基因敲除酵母于液体培养基SD中，30℃，200 rpm，过夜培养16~18h，4500rpm收集菌体，SD培养基将菌体稀释至OD600nm=0.300，继续培养菌体2 h，4500rpm离心收集菌体后，用去离子水洗涤一次，用SD培养基将菌体稀释至OD600nm=0.010，受试纳米CuO，将纳米CuO母液稀释，将纳米CuO受试浓度定为10、20、50及100 µg/ml，移取菌液及纳米CuO悬浮液各75µL于96孔板中，将24 h分别作为受试终点，受试终止时，多功能酶标仪在600nm处检测各孔的吸光值，受试纳米CuO后酵母菌液各孔吸光值，减去纳米CuO溶液本身吸光值，计算生长抑制率；D、数据处理和分析：实验设3个平行，实验结果表示为平均数±标准误差，实验数据采用SPSS13. 0软件进行t检验及单因素方差分析，p﹤0.05表示差异；E、试验结果：敲除与膜通透性及氧化损伤修复相关基因的酵母突变株受试纳米CuO时，其敏感性增强，其中五基因缺失突变株与野生型相比，其对纳米材料的敏感性有显著性提高；F、...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：方涛，鲍少攀，陆其聪，唐巍，戴和平，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42