梨转录因子PsJOINTLESS及其应用制造技术

本发明专利技术公开了梨转录因子PsJOINTLESS及其应用。一种分离自‘库尔勒香梨’具有促进植物器官脱落功能的转录因子PsJOINTLESS基因，属于MADS-box家族成员，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示。通过农杆菌介导遗传转化方法将转录因子转化番茄，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明专利技术克隆的PsJOINTLESS基因具有促进植物器官脱落的功能。PsJOINTLESS基因的发现，为促进植物器官脱落的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

【技术实现步骤摘要】
梨转录因子PsJOINTLESS及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域，涉及梨转录因子PsJOINTLESS及其应用，具体涉及从‘库尔勒香梨’中分离、克隆得到一个植物器官脱落相关的MADS-box家族成员PsJOINTLESS基因及其应用。
技术介绍
器官脱落，是指植物细胞、组织或器官脱离母体的生理过程。器官脱落是细胞结构、代谢和基因表达变化共同作用的结果。一般情况下，把器官或组织脱落的组织区域及其邻近部分称为“离区(AbscissionZone)”，而把此区域内仅发生组织与细胞分离的数层细胞叫“离层”。对多种植物园艺植物器官离区的解剖结构观察显示，不同植物离层细胞大小有3种类型：①离层细胞比邻近细胞小，大多等径；离层细胞比邻近细胞小，大多长方形；离层细胞大小与相邻细胞近似。器官或组织脱落的组织区域内细胞小而等径，胞质致密，胞间隙小(Dengetal,2007；Rosalesetal,2009；Ayehetal,2009)。植物激素在植物器官脱落的发生过程中起着一定的作用，其中乙烯和生长素类激素发挥主要作用(Meiretal,2010；PattersonandBleecker,2004)。生长素在器官脱落过程中与乙烯的作用相拮抗，它控制离区细胞在适当的时间对乙烯产生应答，而乙烯则影响生长素的极性运输。器官分离脱落是细胞壁和中胶层在离层部位断裂的结果。在离层产生的过程中，果胶降解，胞间层增大，开孔并消失，期间伴随微纤丝结构解体，呼吸代谢和细胞壁水解酶活性的增加。目前研究最多的是脱落相关的酶类主要有多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)、纤维素酶(Cellulase，EG)。此外，参与细胞壁降解的酶类还有果胶甲酯酶(Pectinmethylesterase，PME)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase，PAL)、几丁质酶(Chitinase)、多酚氧化酶、膜相关的类受体蛋白激酶(Burretal,2011)等也与植物器官脱落有关(Bunya-atichartKetal,2011；Wangetal,2005)。脱落过程伴随着一系列基因表达的变化，已经鉴定出多个与离区发育相关的基因。如拟南芥中已发现的控制花器官离区发育的唯一一对功能重复基因BLADEONPETIOLE1/2(BOP1/2)，双突变体bop1bop2中不能形成花器官离区，而像叶柄发育和器官的非对称性生长等性状也受到不同程度的影响(Norbergeetal,2005；McKimetal,2008)。影响番茄花柄离区发育的基因LATERALSUPPRESSOR(LS)，该基因突变后部分花柄离区发育受到影响而消失(Schumacheretal.,1999)。番茄中，还有其他的一些基因本身并不影响离区的形成，但在器官脱落中起着一定的作用。利用VIGS系统特异沉默了TAPGs(tomotoabscission-relatedpolygalacturonases)基因，能够延迟乙烯处理后番茄叶片的脱落和增加叶片断裂力，说明此类基因在番茄叶片脱落的过程中扮演重要的角色(Jiangetal.,2008)。番茄中的CEL1(cellulase1)基因也参与番茄花柄脱落的过程(Gonzalez-Boschetal.,1997)。番茄1,4-β-葡聚糖酶(cel2)反义抑制转基因植株中，显著提高了番茄果实离区的断裂力(Brummellletal.,1999)。对于植物离区发育在模式植物拟南芥、经济作物番茄、禾本科作物水稻、小麦中的解析，很大程度上帮助植物育种专家有效解决禾本科植物落粒、果树生理落果、豆类作物提前开荚等问题。必须指出的是，虽然已经从不同物种中克隆出JOINTLESS序列，但是大部分JOINTLESS序列在器官脱落过程中的功能仍有待进一步验证。此外，有关JOINTLESS的大部分信息来源于茄科植物，如番茄、辣椒等，但有关果树的JOINTLESS的研究则非常有限。本专利技术以‘库尔勒香梨’为试材，利用同源克隆技术，克隆得到梨JOINTLESS基因的全长序列，并分析其在脱萼处理、宿萼处理下不同时期花萼不同部位的表达特性；构建植物超表达载体，通过根癌农杆菌介导法遗传转化Micro-Tom番茄使其过量表达，证明其可能参与番茄花(果)柄离区发育的过程，从而扩展了离区发育的分子调控途径。另外，克隆梨中有关器官脱落的基因很大程度上提高作物改良和育种的效率，对农业生产也具有非常重要的理论和实践意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种促进落花落果转录因子PsJOINTLESS基因。本专利技术的另一目的是提供该基因的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：一种分离自‘库尔勒香梨’具有促进植物器官脱落功能的转录因子PsJOINTLESS基因，属于MADS-box家族成员，其核苷酸序列为SEQIDNo.1所示，包含672bp的开放阅读框；编码224个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQIDNo.2所示，等电点为5.48，分子量为25.43kDa。。含有本专利技术所述PsJOINTLESS基因的重组表达载体。所述的重组表达载体，优选以pCAMBIA1301为出发载体，所述PsJOINTLESS基因的插入位点为NcoI和BstEII之间。含有本专利技术所述PsJOINTLESS基因的宿主菌。克隆本专利技术所述PsJOINTLESS基因cDNA序列的引物对，上游引物PsJOINTLESS-F1序列如SEQIDNo.3所示，下游引物PsJOINTLESS-R1序列如SEQIDNo.4所示。本专利技术所述PsJOINTLESS基因在促进番茄花(果)柄脱落中的应用。本专利技术所述的重组表达载体在促进番茄花(果)柄脱落中的应用。有益效果与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和效果：1.PsJOINTLESS基因的发现，为促进植物器官脱落的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。2.通过农杆菌介导遗传转化方法将转录因子转化番茄，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本专利技术克隆的PsJOINTLESS基因具有促进植物器官脱落的功能。附图说明图1为本专利技术PsJOINTLESS基因在脱萼处理和宿萼处理后的时空表达模式分析。图2为本专利技术PsJOINTLESS基因亚细胞定位示意图。其中：图A，GFP基因(对照)在明场、图B，紫外线(UV)光下的成像，图C为二者叠加后的成像；图D和图E，PsJOINTLESS基因在明场、UV光下的成像，图F为二者叠加后的图像。图3为本专利技术实施例3的载体构建流程示意图。图4为PsJOINTLESS基因转基因植株PCR鉴定示意图。其中，利用PsJOINTLESS基因特异引物PCR鉴定番茄转基因植株。M：DL2000Marker，P：质粒，WT：野生型植株，1-9：转基因株系；具有特异条带的为转基因植株，没有特定条带的为假阳性植株。图5为本专利技术PsJOINTLESS基因在转基因植株的基因表达量分析示意图(半定量RT-PCR)。WT为野生型，其余编号：转基因株系。图6为转PsJOINTLESS基因的番茄表型观察示意图。其中：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离自‘库尔勒香梨’具有促进植物器官脱落功能的转录因子PsJOINTLESS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.分离自‘库尔勒香梨’的转录因子PsJOINTLESS基因在促进番茄花柄和果柄脱落中的应用，其特征在于,所述的PsJOINTLESS基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示;扩增所述PsJOINTLESS基因的cDNA序列的，上游引物PsJOINTLESS-F1序列如SEQIDNo.3所示，下游引物PsJOINTLESS-R1序列如SEQIDNo.4所示;所述转录因子PsJOINTLESS基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2.一种含有转...

【专利技术属性】
技术研发人员：张绍铃，齐笑笑，黄小三，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32