本发明专利技术公开了AFP158-166特异性TCR基因及其转基因T细胞及体外增殖方法及用途,AFP158-166特异性TCR基因，是序列表SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的AFP158-166特异性TCR转基因T细胞，具有对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用。人工抗原递呈细胞在IL-15分泌的同时，可通过细胞表面的MHCI型分子递呈AFP158-166表位肽，诱导AFP特异性的免疫反应，以其体外刺激AFP158-166特异性TCR转基因T细胞增殖，可提高转基因T细胞比例，增强其特异性，并通过IL-15的分泌辅助增强T细胞活性及抗肿瘤能力。
【技术实现步骤摘要】
AFP158_166特异性TCR基因及其转基因 T细胞及体外增殖方 法及用途
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及afp158_166特异性TCR基因、AFP 158_166特异性 TCR转基因 T细胞、AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞的体外增殖方法及AFP158_166特异性 TCR转基因 T细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。
技术介绍
肿瘤特异性T细胞过继性细胞治疗（adoptive cell therapy, ACT)是肿瘤免疫治 疗的最新进展。细胞免疫尤其是CD8+T细胞介导的特异性MHC-I类分子限制性细胞免疫功 能在抗肿瘤免疫中起决定作用。T淋巴细胞通过特异性T细胞受体（Tcell rec印tor，TCR) 识别肿瘤细胞表面抗原肽-MHC复合物而被激活。活化的T细胞可以直接溶解肿瘤细胞，或 通过分泌细胞因子，如干扰素和肿瘤坏死因子，抑制肿瘤生长，阻止肿瘤血管生成。 分子生物学技术的进步使制备转基因 Τ细胞成为可能，可以肿瘤特异性Τ细胞克 隆分离获得其特异性TCR，通过病毒载体导入患者淋巴细胞，特异性TCR转基因 Τ细胞具有 MHC限制的细胞毒性，杀伤表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞，再以适当的方法体外大量扩增特 异性TCR基因修饰的多克隆Τ细胞进行过继性免疫治疗，已在临床试验中取得一定疗效。 甲胎蛋白（alpha_fetoprotien，AFP)是原发性肝癌的肿瘤标志物，约有50%的肝 癌患者的肿瘤细胞表达AFP。研究表明AFP含有多个MHC-Ι型限制性抗原表位，可激活细胞 毒性T细胞。AFP 158_166表位肽是其中之一，其可刺激从健康志愿者外周血分离的T细胞产 生免疫应答。 过继性细胞治疗的另一障碍是特异性T细胞的体外扩增。有效的抗原递呈，共刺 激信号的存在和适宜的细胞因子环境是体外诱导抗原特异性T细胞增殖的关键。目前的 体外增殖系统需要将抗原，共刺激分子和细胞因子共同加入培养体系，或需要培养自体树 突状细胞，其效率和经济性对细胞治疗的临床应用构成不利影响。B淋巴瘤细胞表达大量 的MHC和共刺激信号分子，在体外易于培养，如果导入肿瘤抗原和细胞因子基因使其表达 肿瘤抗原和细胞因子，放射线灭活的淋巴瘤细胞可望作为刺激细胞应用于T细胞的体外 扩增。白介素-2(IL-2)是最常用的维持T细胞增殖的细胞因子，但最近的研究表明白介 素-15 (IL-15)能更有效的维持抗原特异性T细胞的功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供AFP158_166特异性TCR基因。 本专利技术的第二个目的是提供AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞。 本专利技术的第三个目的是提供AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞的体外增殖方法。 本专利技术的第四个目的是提供AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞在制备治疗肝癌药 物中的应用。[〇〇1〇] 本专利技术的技术方案概述如下： AFP158_166特异性TCR基因，所述基因是序列表SEQ ID NO. 1所示。 AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞，用下述方法构建：以AFP158_166特异性TCR基因 构建AFP 158_166特异性TCR慢病毒载体，感染多克隆T细胞建立AFP158_ 166特异性TCR转基因 T细胞。 AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞的体外增殖方法，包括如下步骤：以人工抗原递 呈细胞体外刺激AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞；所述人工抗原递呈细胞是AFP158_166抗 原肽基因与IL-15基因在B细胞淋巴瘤系的协同表达。 AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。 本专利技术的优点： 以AFP158_166特异性TCR基因构建的AFP 158_166特异性TCR慢病毒载体，感染多克隆 T细胞建立AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞，使其具有对于AFP阳性肝癌细胞的特异性 杀伤作用。人工抗原递呈细胞在IL-15分泌的同时，可通过细胞表面的MHC I型分子递呈 AFP158_166表位肽，诱导AFP特异性的免疫反应，以其体外刺激AFP158_ 166特异性TCR转基因 T 细胞增殖，可提高转基因 T细胞比例，增强其特异性，并通过IL-15的分泌辅助增强T细胞 活性及抗肿瘤能力。 【附图说明】 图1为AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞细胞毒性作用。 图2为Pr〇5AFP158_166-MHC五聚体（FCM)检测未经人工抗原递呈细胞刺激的 AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞比例。 图3为Pr〇5AFP158_166-MHC五聚体（FCM)检测经人工抗原递呈细胞刺激的AFP 158_166 特异性TCR转基因 T细胞比例。 图4为ELISP0T检测AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞对IFN- γ的分泌。 图 5ELISA 检测 BA15 对 IL-15 表达。 图6为BA15对AFP158-166抗原肽的稳定表达（液相色谱-质谱联用）；其中： 图6-1为标准品液相色谱图（箭头所示位置为标准品出峰位置； 图6-2为标准品在图6-1所示出峰位置的质谱结果； 图6-3为BJAB细胞洗脱液液相色谱图（箭头所示位置为与标准品相同保留时间， 无明显色谱峰出现，质谱检测无信号； 图6-4为W1BA15洗脱液液相色谱图（箭头所示位置为与标准品相同保留时间； 图6-5为W1BA15洗脱液在图6-4所示出峰位置的质谱结果； 图6-6为W6BA15洗脱液液相色谱图（箭头所示位置为与标准品相同保留时间； 图6-7为W6BA15洗脱液在图6-6所示出峰位置的质谱结果。 图7为辐照对BJAB细胞HLA-A2，⑶80，⑶86表达影响：辐照后BJAB细胞对于 ⑶80,⑶86, HLA-A2表达均有下降，但不明显，且与辐照剂量无明显相关性；其中： 图7-1为辐照后BJAB细胞HLA-A2的表达； 图7-2为辐照后BJAB细胞⑶80的表达； 图7-3为辐照后BJAB细胞⑶86的表达。 图8为辐照对BJAB细胞增殖影响。 图9为辐照后BJAB细胞增殖（CFSE法）。 图 10 为 BA15 对 IL-15 的稳定表达（ELISA)。 图11为CFSE法检测不同种类抗原递呈细胞激活AFP158_166特异性TCR转基因 T细 胞增殖；其中： 图11-1为抗原递呈细胞（DC(1:10))激活AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞增 殖； 图11-2为抗原递呈细胞（BA15 (1:10))激活AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞增 殖。 图12为DC和BA15诱导的AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞细胞毒性作用；其 中： 图12-1为DC诱导的AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞细胞毒性作用； 图12-2为BA15诱导的AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞细胞毒性作用。 【具体实施方式】 人工抗原递呈细胞简称BA15。 外周血购于天津市中心血站，经筛选，获得基因型为HLA-A0201。 Η印G2细胞、T2细胞、SW480细胞和SW620细胞购于ATCC。 BJAB细胞购于上海本文档来自技高网...
【技术保护点】
AFP158‑166特异性TCR基因，其特征是所述基因是序列表SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1. AFP158_166特异性TCR基因，其特征是所述基因是序列表SEQ ID NO. 1所示。 2. AFP158_166特异性TCR转基因 T细胞，其特征是用下述方法构建：以AFP158_166特异性 TCR基因构建AFP158_166特异性TCR慢病毒载体，感染多克隆T细胞建立AFP 158_166特异性TCR 转基因 T细胞。 3...
【专利技术属性】
技术研发人员：何向辉，孙龙昊，章志翔，刘彤，
申请(专利权)人：天津医科大学总医院，
类型：发明
国别省市：天津;12
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