一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用制造技术

本发明专利技术提供一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用，所述米曲霉分类命名为米曲霉（Aspergillusoryzae）米3，由中国典型培养物保藏中心保藏，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2013640，保藏日期为2013年12月8日。本发明专利技术菌株以麦麸为发酵基质来发酵生产阿魏酸酯酶，并用阿魏酸酯酶断裂植物细胞壁多糖及木质素和阿魏酸之间的酯键，获得束缚型酚酸阿魏酸的方法，并且利用微生物生长周期短，不受气候限制，易于实现大规模生产，为阿魏酸等束缚型酚酸类物质提取提供了新的生物方法。

【技术实现步骤摘要】
一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用。
技术介绍
小麦是世界上种植面积最为广泛的作物之一，约占粮食作物种植面积的26%，我国 小麦年产量高，小麦麸皮的年产量可达2000万吨以上，但是一直以来对于麸皮的开发利用 较少，基本上仅以作为饲料原料而加以利用。小麦麸皮中主要含有非淀粉多糖、淀粉、脂肪、 木质素、蛋白质、维生素和酚类物质等多种成分，其中以阿拉伯木聚糖为主的非淀粉多糖含 46%，是小麦细胞壁的主要成分。麸皮中还含有一定数量的酚酸类物质，如阿魏酸（ferulic acid)、P_ 香豆酸（p-coumaricacid)、咖啡酸（caffeicacid)、芥子酸（sinapicacid)和丁 香酸（syringicacid)等成分，其中以阿魏酸为主要成分，约为麸皮质量的0. 4%-0. 7%。阿魏 酸主要通过酯键与细胞壁多糖和木质素项链，一般可以使用强碱将酯键断开而释放出来。 酚酸组要存在于麦麸皮层中，其具有较强的抗氧化活性和抗肿瘤作用，并对环境 中的有毒物质如多环芳烃和亚硝酸胺以及真菌毒素有抗诱变作用。有研究报道发现，在麦 麸膳食纤维的离体发酵试验中，结肠微生物能通过发酵作用将结合在麦麸膳食纤维上的阿 魏酸释放出来。而阿魏酸可显著降低人子宫颈癌细胞的生存能力、存活和抗氧化水平，同时 提高癌细胞保内的活性氧水平并增加癌细胞的脂质过氧化及DNA损伤作用。另有报道认 为阿魏酸可通过对血管内皮生长因子（VEGF)、血小板源生长因子（PDGF)和缺氧诱导因子 (HIF)的作用来调节血管的形成。 目前，研究表明酚类物质主要以游离型、结合型和束缚型等几种形式存在于植物 机体内，一般来说，游离性和结合型酚类物质为可溶性酚类；束缚型则为不溶性酚类物质， 以酯键、糖苷键和醚苷键形式与其他物质(包括蛋白质、糖类、有机酸等）相结合。 对于酚类物质的提取，一般采用有机溶剂为媒介，辅以超声、微波、亚临界等方法 进行。由于束缚型酚类物质一般与其他物质以不同的键型相连结，传统的提取方法不足以 将酯键、糖苷键或醚键断裂，因此对束缚型酚类物质的提取主要采用强酸强碱或生物方法 (酶法和发酵法)，其主要目的都是破坏细胞壁纤维成分致密的结构，以使束缚行酚类物质 释放出来。 尽管化学方法操作简单、效率高，但是后续需要处理提取废液，不利于可持续性发 展。因此相比较而言，采用生物方法更符合绿色、环保的发展要求。对于麦麸进行发酵方面 的多集中在低聚木糖生产和产酶活性等领域，另外已有大量文献报道麦麸经发酵后等到膳 食纤维功能性质比发酵前有大幅改善，如持水性、持油性和对有害物质的结合能力等。 阿魏酸作为麦麸中的主要酚酸，目前对其获得的方式主要为酶法，以发酵方式的 报道较少，特别需要指出的是，麦麸中的阿魏酸基本适宜束缚型的形态存在的，其游离型： 结合型：束缚型的比例为〇. 1:1:100。近年来，对酚类物质存在形式的研究逐渐成为新的研 究热点。目前已对一些游离型、酯化型、糖苷型、束缚型酚类物质的提取、测定及抗氧化活性 等方面的报道。酚类物质的存在形与其含量及抗氧化活性有重要关系，束缚型酚类物质不 仅含量远远高于游离型和结合型，且抗氧化性活性和抑制DNA损伤方面要高于其他两种类 型。 本专利技术旨在利用微生物资源采用发酵工程技术将农业资源转化形成人类社会需 求的物质，解决抗氧化物质资源短缺的问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：针对现有抗氧化供应的提供新的原料和方法，并 对小麦等大宗植物进行再利用，提供一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用，其可利用小麦 麸皮发酵生产阿魏酸，由于微生物生长周期短、不受气候限制，易于实现大规模生产，从而 解决阿魏酸不足等问题。 本专利技术提供一株产阿魏酸酯酶的米曲霉，来源于华南理工大学周边植物腐生较多 的土壤，经过筛选，分离纯化得到的。所述米曲霉分类命名为米曲霉(As/76?r^77A/5· oiTzae) 米3,由中国典型培养物保藏中心保藏，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO :M2013640,其ITS 序列表如表1所示，保藏日期为2013年12月8日，保藏地址为中国武汉武汉大学，中国 典型培养物保藏中心。 本专利技术所得米曲霉oiTzae)米3平板观察特征和显微镜特征如下： 米曲霉米3在察氏培养基上菌落生长速度较慢，培养7d直径50mm ; 有辐射状不规则的沟纹，质地丝绒状中央现絮状，分生孢子结构多，无渗出液，反面呈淡粉 红色至淡褐色。在麦芽汁琼脂上菌落生长速度快，培养7d长满全皿，质地丝绒状至厚絮状； 黄绿色近于黄橄榄色后变淡褐橄榄色，反面无色。在査氏酵母膏琼脂上菌落培养7d直径 70mm，具辐射状沟纹，质地丝绒状或絮状；分生孢子结构多，淡黄褐色。 显微镜下可以观察到分生孢子头幼球形后呈辐射形，分生孢子梗发生于基质或气 生菌丝；顶囊近球形至烧瓶形，直径16?45mm，产孢子结构单层或双层，有些统一顶囊上 二种情况兼有，瓶梗8?14μπιΧ3. 5?5μπι;或椭圆形，4. 8 μ mX 4 μ m，壁近于平滑或稍粗 糖。 所述米曲霉 dpergiBiAs orjzae)米 3 的 ITS 与米曲霉 dpergiBiAs orjzae) 同源性达99. 8%。 一株产阿魏酸酯酶的米曲霉，本专利技术的米曲霉来源于华南理工大学周边腐生植物 较多的土壤，采用不同的培养基进行筛选，筛选到多个菌株，逐一进行阿魏酸含量及牛津杯 透明圈测定实验，得到高产阿魏酸酯酶的米曲霉(As/76?r^77A/5· oiTzae)米3,包括如下步 骤：称取土壤样品l〇g放入装有9(Tl00 mL无菌的含玻璃珠的生理盐水的300mL三角瓶中 摇荡18~20min，作10倍递增系列稀释样品匀液1:10、1:100、1:1000、及1:10000，取稀释 样品匀液1:100、1:1000、及1:10000各1. 〇mL分别加入到无菌平皿；再加10?15mL PDA培 养基混合均匀，静置广2 min，于28°C ±1°C倒置培养70?72h，将PDA培养基上单个的菌 落转接到斜面PDA培养基上28°C ±1°C培养70?72h，再转入初筛培养基，于28°C ±1°C培 养58?60h，用牛津杯透明圈实验，筛选得到产阿魏酸酯酶的米曲霉 米3 ;所述土壤样品采集自华南理工大学周边腐生植物较多的土壤。 上述方法中，将从初筛培养基上获得产阿魏酸酯酶的米曲霉接种到三角瓶种子培 养基中，于28°c ±1°C培养58~ 60h，即为米曲霉种子；再将米曲霉种子接种到发酵培养基 中培养，为产阿魏酸的米曲霉的提取物。 初筛培养基：FeS04 · 7H20 0· Olg，NaN03 2. 0 g，KC1 0· 5 g，MgS04 · 7H20 0· 5 g， K2HP041.0g，鹿糖30 g，琼脂20 g，蒸馈水1000m L，pH值自然；121°C灭菌20 min。灭菌后 培养基冷到60°C左右添加无菌的10%阿魏酸乙酯的二甲基甲酰胺溶液100mL，摇匀至均匀 的乳白色倒平板。 种子培养基：FeS04 ·本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株产阿魏酸酯酶的米曲霉，其特征在于，所述米曲霉分类命名为米曲霉（Aspergillus oryzae）米3，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2013640，保藏日期为2013年12月8日，其ITS序列表如表1所示。

【技术特征摘要】
1. 一株产阿魏酸酯酶的米曲霉，其特征在于，所述米曲霉分类命名为米曲霉 (Aspergi/AAs· 米3,由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO : M2013640,保藏日期为2013年12月8日，其ITS序列表如表1所示。2. 权利要求1所述米曲霉应用于产阿魏酸酯酶中。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：利用天然麦麸直接接种米 曲霉(As/76?r^77A/5· oiTzae)米3,进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴晖，胡博涵，赖富饶，刘素纯，曾岚，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44