胚珠体细胞特异性启动子及使用方法技术

本发明专利技术公开了用于调节异源核苷酸序列在植物中的表达的组合物和方法。组合物包含若干拟南芥(Arabidopsis thaliana)胚珠体细胞组织优选启动子AT-CYP86C1、AT-PPM、AT-EXT、AT-GILT1和AT-TT2的核苷酸序列。还提供了使用本文公开的启动子序列在植物中表达异源核苷酸序列的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
[〇〇〇1] 本专利技术涉及植物分子生物学领域，更具体而言涉及植物中基因表达的调节。
技术介绍
异源DNA序列在植物宿主中的表达有赖于在该植物宿主中有功能的可操作连接 的调节元件的存在。启动子序列的选择将决定在生物体中何时和何处表达异源DNA序列。 需要在特定组织或者器官中表达的情况下，可以使用组织优选启动子。需要应答于刺激而 表达基因的情况下，诱导型启动子是首选的调节元件。相比之下，在需要在植物的整个细胞 中持续表达的情况下，采用组成型启动子。可以在转化载体的表达构建体中包括位于核心 启动子序列上游和/或下游的另外调节序列，以便引起异源核苷酸序列在转基因植物中不 同水平的表达。 常常需要在植物的特定组织或器官中表达DNA序列。例如，可以通过遗传操纵植 物的基因组以包含可操作连接至异源病原体抗性基因的组织优选启动子，从而在所需植物 组织中产生病原体抗性蛋白质，实现植物对土源和空气源病原体感染的抗性增加。或者， 可能需要抑制植物组织内的天然DNA序列的表达以实现所需的表型。在这个情况中，可以 如下实现这种抑制：将植物转化以使其包含可操作连接至反义核苷酸序列的组织优选启动 子，从而该反义序列的表达产生了干扰天然DNA序列的mRNA翻译的RNA转录物。 另外，可能需要在处于特定生长或发育阶段（例如细胞分裂或伸长）的植物组织 中表达DNA序列。这种DNA序列可用于促进或抑制植物生长过程，从而影响植物的生长速 率或结构（architecture)。 为了影响植物的各种性状和为了与可评分标志物（scorable marker) -起使用， 需要分离和表征胚珠体细胞（somatic ovule)组织优选的启动子，特别是能在种子发育早 期充当目的分离核苷酸序列的表达的调节元件的启动子。
技术实现思路
提供用于调节植物中基因表达的组合物和方法。组合物包含在授粉之前、授粉过 程中和授粉之后在胚珠体细胞组织中活跃的启动子的新型核苷酸序列。这种优选表达对于 筛选不定胚生殖是特别合乎需要的。更具体而言，该启动子在胚珠中活跃，大约在受精时和 在受精之前直至球形胚形成为止主要在拟南芥（Arabidopsis)的内珠被的珠孔端。本专利技术 的某些实施例包含SEQ ID NO :3-8和33所示的核苷酸序列及其功能片段，其驱动可操作连 接的核苷酸序列的胚珠优选表达。本专利技术的实施例还包括包含可操作连接到目的异源核苷 酸序列的启动子的DNA构建体，其中所述启动子能够驱动所述核苷酸序列在植物细胞中的 表达，并且所述启动子包含本文公开的核苷酸序列中的一个。本专利技术的实施例还提供表达 载体，以及在其基因组中稳定掺入了如上所述的DNA构建体的植物或植物细胞。另外，组合 物包括这种植物的转基因种子。具有这种优选空间和时间表达的启动子对于双子叶植物中 的不定胚生殖是特别合乎需要的。不定胚生殖是无孢子生殖的单性生殖（通过种子无性繁 殖）的组成部分，其在使稳定的、基于杂种的杂种优势维持数代中将有用。 另外的实施例包括在植物中选择性表达核苷酸序列的方法，该方法包括用DNA构 建体转化植物细胞，并从所述植物细胞再生出转化植物，所述DNA构建体包含本专利技术的启 动子和可操作连接到所述启动子的异源核苷酸序列，其中所述启动子启动所述核苷酸序列 在再生的植物中的胚珠优选转录。按这种方式，启动子序列可用于以组织优选方式控制可 操作连接的编码序列的表达。 在启动子的转录起始区的下游将是目的序列，其将提供对植物的表型的修饰。这 种修饰包括调节内源产物的生成（数量、相对分布等方面）或者外源表达产物的生成，以在 植物中提供新颖的或者经调节的功能或产物。例如，涵盖编码这样的基因产物的异源核苷 酸序列，该基因产物赋予对除草剂、盐、寒冷、干旱、病原体、线虫或昆虫的抗性或耐受性。 在另一个实施例中，提供了调节基因在稳定转化的植物中的表达的方法，该方法 包括以下步骤：（a)用包含与至少一种核苷酸序列可操作连接的本专利技术的启动子的DNA构 建体转化植物细胞；(b)使该植物细胞在植物生长条件下生长，以及（c)从其中该连接的核 苷酸序列的表达改变该植物的表型的植物细胞再生出稳定转化的植物。 【附图说明】 图l(A-D)示出了在胚珠中可操作连接至本专利技术的经修饰的NUCl(ALTl)启动 子（PHP42329)的异源基因（GUS)的表达模式，该模式与和本专利技术的拟南芥NUC1启动子 (PHP37811) -起所观察到的模式相同。（A)为具有成熟胚囊的拟南芥胚珠的参考示意图， 其示出了卵（红色）、2个助细胞（绿色）、中央细胞（蓝色）和3个反足细胞。表达处于 (B)大配子体阶段、（C)卵阶段和⑶球形胚阶段。表达模式可见于内珠被的珠孔顶端，合 点地（chalazally)扩散穿过围绕胚囊的珠孔一半的内珠被。在球形胚阶段⑶期间，表达 从珠孔内珠被过渡到合点珠被，并且在心形胚阶段，表达仅在与合点端（未示出）相对的珠 被中观察到。 图2示出了在（A)卵阶段、(B)鱼雷形胚阶段和（C)晚期球形胚阶段，在胚珠中可 操作连接至启动子AT-CYP86C1的异源基因（DS-RED)的表达模式。该表达模式可见于内珠 被（A)的珠孔顶端，合点地扩散穿过内种皮以围绕胚囊的基部，还扩散到外珠被（B)的珠孔 端，并且然后继续合点地扩散穿过整个内种皮层（C)。 图3和4示出了在卵阶段，在胚珠中可操作连接至启动子AT-CYP86C1的异源基因 (DS-RED)的表达模式。在成熟胚囊阶段（卵阶段），AT-CYP86C1 pro :Ds-Red表达局限于 围绕胚囊的珠孔端并且与其相对的内珠被。 图5示出了在卵/接合子阶段，在胚珠中可操作连接至启动子AT-CYP86C1的异源 基因（DS-RED)的表达模式。在受精时或在受精之后，AT-CYP86C1 pr〇:DS-Red表达仍局限 于围绕胚囊的珠孔端并且与其相对的内珠被。表达在开始于胚珠的远轴侧上的内种皮层中 合点地延伸。 图6(A和B)示出了在接合子阶段，在胚珠中可操作连接至启动子AT-CYP86C1的 异源基因（DS-RED)的表达模式。AT-CYP86C1 pr〇:DS-Red表达保持强烈地局限于围绕胚 囊的珠孔端并且与其相对的内珠被。表达在开始于胚珠的远轴侧上的内种皮层中合点地延 伸。表达还可见于与胚囊的珠孔端相对的外珠被中。 图7和8(7A-C和8A-C)示出了在鱼雷形胚阶段，在胚珠中可操作连接至启动子 AT-CYP86C1的异源基因（DS-RED)的表达形式。AT-CYP86C1 pro:Ds-Red表达保持强烈地 局限于围绕胚囊的珠孔端并且与其相对的内珠被。表达在与胚囊的珠孔端相对的外珠被中 变得更普遍和更强。表达在内种皮层中继续合点地延伸。 图9(A和B)示出了在球形胚阶段，在胚珠中可操作连接至启动子AT-CYP86C1的 异源基因（DS-RED)的表达模式。 图10(A、B和C)示出了在晚期球形胚阶段，在胚珠中可操作连接至启动子 AT-CYP86C1的异源基因（DS-RED)的表达模式。 图ll(A-D)示出了在接合子阶段，在胚珠中可操作连接至启动子AT_PPM(推定的 果胶甲酯酶）的异源基因（ZS-Green)的表达模式。对于ΑΤ-PPM启动子，观本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含选自以下的多核苷酸：(a)包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8和33核苷酸序列的核苷酸序列；(b)包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8和33核苷酸序列的片段或变体的核苷酸序列，其中所述序列在植物细胞中启动转录；(c)与(a)或(b)的所述多核苷酸互补的多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.01.06 US 61/5836461. 一种分尚的核酸分子，所述分尚的核酸分子包含选自以下的多核苷酸： (a) 包含SEQ ID NO :3、4、5、6、7、8和33核苷酸序列的核苷酸序列； (b) 包含SEQ ID N0:3、4、5、6、7、8和33核苷酸序列的片段或变体的核苷酸序列，其中 所述序列在植物细胞中启动转录； (c) 与（a)或（b)的所述多核苷酸互补的多核苷酸。2. -种表达盒，所述表达盒包含可操作连接到目的异源多核苷酸的权利要求1所述的 多核苷酸。3. -种载体，所述载体包含权利要求2所述的表达盒。4. 一种植物细胞，所述植物细胞包含权利要求2所述的表达盒。5. 根据权利要求4所述的植物细胞，其中所述表达盒被稳定整合到所述植物细胞的基 因组中。6. 根据权利要求4所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。7. 根据权利要求6所述的植物细胞，其中所述单子叶植物选自包含下列的组：玉蜀黍、 小麦、水稻、大麦、高粱、粟、甘蔗和裸麦。8. -种植物，所述植物包含权利要求2所述的表达盒。9. 根据权利要求8所述的植物，其中所述植物是单子叶植物。10. 根据权利要求9所述的植物，其中所述单子叶植物选自包含下列的组：玉蜀黍、小 麦、水稻、大麦、高粱、粟、甘鹿和裸麦。11. 根据权利要求8所述的植物，其中所述植物是双子叶植物。12. 根据权利要求9所述的植物，其中所述双子叶植物选自包含下列的组：大豆、芸苔 属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。13. 根据权利要求2-12中任一项所述的植物，其中所述表达盒被稳定整合到所述植物 的基因组中。14. 一种权利要求8所述的植物的转基因种子，其中所述种子包含所述表达盒。15. 根据权利要求8所述的植物，其中所述目的异源多核苷酸编码参与器官发育、干细 胞发育、细胞生长刺激、器官发生、体细胞胚发生启动、自繁殖植物和顶端分生组织发育的 基因产物。16. 根据权利要求15所述的植物，其中所述基因选自：WUS、CLAVATA、Babyboom、 LEC(leafy cotyledon)、RKD、EMBRY0MAKER、ARI7 MYB115 和 MYB118 基因。17. 根据权利要求8所述的植物，其中所述目的异源多核苷酸编码赋予干旱耐受性、寒 冷耐受性、除草剂耐受性、病原体抗性或昆虫抗性的基因产物。18. 根据权利要求8所述的植物，其中所述多核苷酸的表达改变所述植物的表型。19. 一种在植物或植物细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括将包含可操作连接 到目的异...

【专利技术属性】
技术研发人员：MA钱伯林，SJ拉维特，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国;US