贝类中大田软海绵酸类毒素的快速检测试剂盒制造技术

一种贝类中大田软海绵酸类毒素的快速检测试剂盒，属于食品检测技术领域，它包括:(1)蛋白磷酸酶2A冻干粉；(2)大田软海绵酸浓度梯度系列标准溶液；(3)缓冲溶液；(4)蛋白磷酸酶2A稀释溶液；(5)底物显色溶液；(6)高浓度加标溶液。本发明专利技术技术方案继承了小鼠生物法能建立剂量-效应关系的优势，直接反映毒素的相对毒性大小，但与小鼠生物法相比，可在更短时间内检测大批量样品(84个样品<4h)。本发明专利技术方法的检出限为50μg OA eq./kg贝组织，与传统的小鼠生物法的检出限200μg OA eq./kg贝组织相比，大幅度降低。同时避免了动物实验的伦理问题。本发明专利技术试剂盒成本低廉，操作简便。

【技术实现步骤摘要】
贝类中大田软海绵酸类毒素的快速检测试剂盒
本专利技术属于食品检测
，具体地涉及一种贝类中大田软海绵酸类毒素的快 速检测试剂盒。
技术介绍
贝类以其鲜美的口味和丰富的营养，深受广大消费者喜爱，成为我国渔业产业的 主导品种，但贝体内毒素的富集多年来一直困扰我国贝类产业的健康发展。近年来对我国 部分海域贝类产区的调查显示，在辽东湾、莱州湾、秦皇岛、福建等海域均发现了贝毒素，并 以大田软海绵酸（okadaic acid，0A)类毒素比较普遍。0A类毒素属多环聚醚类脂溶性贝毒 素，具热稳定性，可在贝类组织中残留较长时间；且加热、微波等常规加工方式因降低水产 品中的水分含量而导致毒素浓度更高，所以此类毒素给消费者带来的潜在危害更难预防， 已成为发达国家制定监控计划和贸易壁垒的主要目标。研究证实，0A类毒素的组分为0A及 其多种衍生物鳍藻毒素（dinophysistoxins，DTXs)，且0A及DTXs能够抑制蛋白磷酸酶的 活性，是一类潜在的肿瘤促进因子。欧盟、德国和英国等多个国家规定双壳贝类可食性组织 中0A类毒素不大于160 μ g/kg (以0A计），我国GB/T18406. 4-2001《农产品安全质量无公 害水产品安全要求》规定的限量值为600 μ g/kg。 现有0A类毒素的检测技术包括小鼠生物法、仪器分析法、免疫分析法以及蛋白磷 酸酶抑制分析法（protein phosphatase inhibition assay，PPIA)。其中小鼠生物法作为 目前使用最为广泛的检测方法，其毒素总量的测定可较直接和准确反映目标毒素的毒性大 小，多年来世界范围内均未出现因方法本身问题而出现的中毒事件，但由于存在毒素提取 过程繁琐、需时较长，检出限偏高（200 μ gOA eq./kg贝组织）等局限性及动物福利的原因， 欧盟指令（EC)N〇15/2011规定该方法作为官方标准方法仅限于在2014年12月31日前使 用，以液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS)作为取代的标准检测方法，并鼓励建立功能性检 测方法（PPIA法）等作为LC-MS/MS的补充。LC-MS/MS法准确、灵敏，但需要价格昂贵的仪器 和专业的人员操作，不能实现快速和现场检测；PPIA法继承了小鼠生物法能建立剂量-效 应关系的优势，直接反映毒素的相对毒性大小，可在短时间内检测大量样品，且降低了检出 限和成本，避免了动物实验的伦理问题，具有很好的发展潜力。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供一种贝类中大田软海绵酸类毒素快速检测试剂盒， 以克服现有检测方法繁琐、检测耗时、仪器昂贵，难以实现现场、快速检测等缺陷。本专利技术基 于大田软海绵酸及其衍生物鳍藻毒素能抑制蛋白磷酸酶活性的特点而研制了一种利用蛋 白磷酸酶活性变化检测0A类毒素总毒性当量的检测试剂盒（以0A浓度计），样品前处理过 程简单，检测快速、费用低廉，可同时检测大批量样品。 本专利技术是通过以下技术方案实现的： -种贝类中大田软海绵酸类毒素的快速检测试剂盒，包括： (1)蛋白磷酸酶2A冻干粉；（2)大田软海绵酸浓度梯度系列标准溶液；(3)缓冲溶 液；(4)蛋白磷酸酶2A稀释溶液；（5)底物显色溶液；(6)高浓度加标溶液； 进一步，所述的大田软海绵酸浓度梯度系列标准溶液，浓度分别为：0,0. 8,1.2， 1. 5,2· 0 和 2· 5μ g/L。 进一步，所述的缓冲溶液具体是指pH8. 4并包含以下终浓度成份：30mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,20mmol/L MgCl2〇 进一步，所述的蛋白磷酸酶2A稀释溶液为用所述缓冲溶液配制的0. 2mg/mL牛血 清白蛋白溶液，并含终浓度为2mmol/Ll，4-二巯基苏糖醇。 进一步，所述的底物显色溶液为浓度为25mmol/L对硝基苯磷酸二钠溶液，用所述 的蛋白磷酸酶2A稀释溶液配制对硝基苯磷酸二钠溶液。 进一步，所述的高浓度加标溶液为1. 6?5. 0 μ g/mL大田软海绵酸标准溶液。 本专利技术提供一种采用所述的试剂盒检测样品中的大田软海绵酸类毒素的方法，具 体步骤如下：（1)制备样品溶液；(2)加入大田软海绵酸浓度梯度系列标准溶液和样品溶 液；（3)加入蛋白磷酸酶2A，振荡混合，孵育；(4)加入底物显色溶液，振荡混合，避光孵育显 色；（5)测定显色后溶液的吸光度值；(6)绘制标准曲线，计算样品中大田软海绵酸类毒素 的浓度。 进一步，所述的制备样品溶液的方法为：称取匀浆的贝样，加入甲醇，均质提取，离 心，再移取甲醇提取液至离心管，先加入NaOH，涡旋，水浴中恒温加热，再加入HC1中和，最 后，将溶液氮吹近干，加入缓冲溶液定容。 进一步，所述的制备样品溶液的基质浓度为10mg/mL。 进一步，所述的步骤（3)的孵育温度为30±2°C，孵育时间20±0. 5min。 进一步，所述的步骤（4)的孵育温度为30±2°C，孵育时间30±0. 5min。 进一步，所述的步骤（5)的测定吸光度值的波长为405nm。 本专利技术与现有技术相比的有益效果： (1)本专利技术技术方案与高效液相色谱和液相色谱-串联质谱等仪器检测技术相 t匕，本试剂盒成本低廉，操作简便，不需专业技术人员即可完成检测，可满足不同层次人员 需要。 (2)本专利技术技术方案继承了小鼠生物法能建立剂量-效应关系的优势，直接反映 毒素的相对毒性大小，但与小鼠生物法相比，可在更短时间内检测大批量样品（84个样品 <4h)。本专利技术方法的检出限为50 μ g 0A eq./kg贝组织，与传统的小鼠生物法的检出限 200yg 0A eq./kg贝组织相比，检出限大幅度降低。同时避免了动物实验的伦理问题。 (3)本专利技术的快速检测试剂盒，简化了样品前处理和检测步骤，准确率高，经济、便 携，适合现场快速筛选。 【附图说明】 图1为不同基质浓度对PP2A酶活性抑制率的影响。 图2为大田软海绵酸对PP2A酶的抑制曲线图。 图3为大田软海绵酸类毒素快速检测试剂盒测定0A的标准曲线图。 【具体实施方式】 下面通过实施例对本专利技术的技术方案做进一步解释，但本专利技术的保护范围不受实 施例任何形式上的限制。 实施例1 -种贝类中大田软海绵酸类毒素的快速检测试剂盒，具体包括： (1)96孔微孔板（美国Corning公司）；可拆卸成12条微孔条，可以一次测试多个 样品，也可以拆开分次测试，剩余的微孔条可以储存在自封袋内，下次使用。 (2)蛋白磷酸酶2A冻干粉（西班牙宙斯生物技术公司），2.5U/支，共5支；使用 前每支酶冻干粉以2mL蛋白磷酸酶2A稀释溶液配制，配制时在室温（22 ±2 °C)下酶标振荡 器上轻微振荡（转速< 60rpm)60±5min使其充分水解，配制后应立即使用。 (3)大田软海绵酸浓度梯度系列标准溶液；大田软海绵酸浓度梯度系列标准溶液 共 6 瓶，浓度分别为：0,0· 8,1. 2,1. 5, 2. 0 和 2. 5 μ g/L。 (4)缓冲溶液：ρΗ8·4并包含以下终浓度的成份30mmol/L Tris-HC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种贝类中大田软海绵酸类毒素的快速检测试剂盒，其特征在于它包括:(1)蛋白磷酸酶2A冻干粉；(2)大田软海绵酸浓度梯度系列标准溶液；(3)缓冲溶液；(4)蛋白磷酸酶2A稀释溶液；(5)底物显色溶液；(6)高浓度加标溶液；

【技术特征摘要】
1. 一种贝类中大田软海绵酸类毒素的快速检测试剂盒，其特征在于它包括： (1)蛋白磷酸酶2A冻干粉；（2)大田软海绵酸浓度梯度系列标准溶液；（3)缓冲溶液； (4)蛋白磷酸酶2A稀释溶液；(5)底物显色溶液；(6)高浓度加标溶液；2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的大田软海绵酸浓度梯度系列标准 溶液，浓度分别为：〇,〇. 8,1. 2,1. 5, 2. 0 和 2. 5 μ g/L。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的缓冲溶液具体是指pH8. 4并包含 以下终浓度成份：30mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA, 20mmol/L MgCl2。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的蛋白磷酸酶2A稀释溶液为用所述 缓冲溶液配制的〇. 2mg/mL牛血清白蛋白溶液，并含终浓度为2mmol/Ll，4-二巯基苏糖醇。5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的底物显色溶液为浓度为25mmol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液，用所述的蛋白磷酸酶2A稀释溶液配制对硝基苯磷酸二钠溶液。6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的高浓度加标...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭萌萌，谭志军，李兆新，王智，吴海燕，赵春霞，翟毓秀，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37