本发明专利技术涉及一种可实现蛋白质定量分析前处理全过程的新型固相萃取(SPE)装置，该装置利用隔板将SPE管分隔为两个等体积的腔室，装填色谱填料后，可原位实现蛋白质样品变性、还原、烷基化、酶解、同位素标记和混合等定量蛋白质组学中样品处理的全过程。该装置制作简便，制作成本低，处理样品时具有回收率高、易操作、定量结果准确度好，精密度高等优点。
【技术实现步骤摘要】
一种双通道SPE柱及其在定量蛋白质组学的应用
本专利技术设计了一种双通道的SPE装置，可实现蛋白质样品原位变性、还原、烷基化、酶解、标记和除盐混合等定量蛋白质样品处理的全过程。
技术介绍
定量蛋白质组学是系统生物学研究的热点内容，它为发现疾病生物标志物，发现蛋白质-蛋白质相互作用，药物-蛋白相互作用，解释疾病发生机理，解释生物学代谢过程等提供极为重要的数据支持。蛋白质是生命活动的体现者和承担者，在生物体内含量极为丰富，参与生命体所有代谢过程，因而蛋白质含量的变化会导致生理学的变化，而对于人类而言，则体现为疾病的发生，因而实现蛋白质的准确定量对于理解疾病发生的机理极为重要。 现有的定量方法主要是基于液相色谱质谱联用方法，这其中基于化学标记的稳定同位素标记方法使用尤为广泛，因为该方法适用于任何来源的蛋白质样品。该方法的样品预处理过程包括蛋白质提取，尿素变性，二硫苏糖醇(DTT)还原，碘乙酰胺(IAA)烷基化，胰蛋白酶酶解和二甲基化标记，终止标记和C18反相除盐，如此多的操作过程极容易样品损失和污染。现有的解决办法是过滤辅助样品制备(FASP) (Nat Methods, 2009.6:359)，但是该方法样品回收率低且无法应于化学标记样品的分析；Heck等在SPE内实现二甲基化标记(Nature Protocols, 2009.4:484),但是该方法忽视了标记前样品损失。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的在于发展一种双通道的SPE柱，原位实现蛋白质样品处理的所有过程，以期平行处理两种样品，降低样品损失，实现高效而简便的样品预处理并获得高准确度和高精密度的定量结果。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为: 一种双通道SPE柱， 包括上端开口、下端密闭的横截面直径为50ym-5cm的圆柱或圆锥形容器，于容器内部的密闭端处设有柱塞或筛板；沿容器内部轴向设有一隔板，隔板将容器的内部空腔分隔成左右体积相同的两等份，形成两个通道；密封后向两个通道内填充等质等量的色谱填料；于密闭端设有流出液出口，流出液出口的中心轴线处于隔板上。 容器包括:20-5000 μ L移液器枪头，l_20ml固相萃取(SPE)管，l_20ml注射器针管中的一种。 所述柱塞可以是在柱管内原位合成的整体柱柱塞；筛板为其上设有孔径为3nm_20 μ m通孔的筛板。 同一 SPE的两通道内的填料可以是反相填料或者离子交换填料； 反相填料包括:C18反相填料、CS反相填料、C4反相填料中的一种，粒径为 1.7 μ m.-100 μ m ;离子交换填料包括:SCX填料和WCX填料中的一种；填料形态包括:颗粒型材料或整体材料。 于流出液出口远离容器侧设有中空的圆管，圆管通过流出液出口分别与两个互不连通通道相连通，隔板与柱塞或筛板密闭连接，隔板与容器内壁密闭连接；所述隔板为聚四氟乙烯箔片或其他防水防有机溶剂的塑料箔片。 所述双通道SPE柱在定量蛋白质组学的应用。 用于蛋白质样品处理过程；1)在SPE柱的两个通道内分别加入100 μ L变性剂溶液(如8Μ尿素，6Μ盐酸胍或1%SDS等)溶解的1-1000 μ g的蛋白质，随后加入还原剂使终浓度为1mM (二硫苏糖醇(DTT)、磷酸三氯乙酯(TCEP)，或β -巯基乙醇等)进行蛋白质的还原，随后加入烷基化试剂使终浓度为55mM (碘代乙酸或碘乙酰胺)进行蛋白质的烷基化处理，用缓冲盐溶液将变性剂浓度稀释10倍后，按照蛋白:酶=50:l(w/w)加入蛋白酶进行蛋白质的37°C水浴酶解过夜，由于隔板的存在，可以在两个通道内分别加入到以上试剂；酶解完成后，首先用起到平衡缓冲液(平衡缓冲为体积浓度0.1%TFA的水溶液)冲洗；2)然后向两个通道内分别加入标记试剂，标记完成后，首先用起到平衡缓冲液(平衡缓冲为体积浓度0.1%TFA的水溶液)冲洗，然后用洗脱缓冲液(当填料为反相填料时，洗脱缓冲液为含有体积浓度0.1%三氟乙酸的体积浓度80%CAN水溶液，或者填料为SCX色谱填料时，洗脱缓冲液为pH3.0的含IM NaCl的10_20mM的磷酸化缓冲液)进行洗脱； 当填料为SCX、或WCX时，还需要进行除盐(用C18捕集柱除盐)；蒸干，以用于质谱分析。 步骤(I)中所述的缓冲盐溶液为:磷酸盐缓冲液、碳酸氢铵缓冲液、硼酸盐缓冲液中的一种； 步骤(2)中所述的标记试剂及对应的溶剂可以为: a:甲醛和氰基硼氢化钠、氘代甲醛和氰基硼氢化钠、或13C-氘代甲醛和氰基硼氘化钠，溶剂可以为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、或三乙胺-碳酸缓冲液(TEAB缓冲液)，标记试剂的加入量为每100 μ g蛋白质16 μ L体体积浓度0.01-40%的甲醛、氘代甲醛或13C-氘代甲醛和16 μ L0.006-6Μ的氰基硼氢化钠或氰基硼氘化钠； 或者b:1TRAQ或mTRAQ试剂，溶解体系为溶于体积浓度70%乙醇水溶液的0.01-1M的TEAB溶液，标记试剂的加入量为每100 μ g蛋白质需要100 μ L0.01-1Μ的iTRAQ或mTRAQ试剂。 蛋白质为生物样品的组织、细胞、或体液的蛋白质提取液或者标准蛋白；蛋白酶可以选择碱性蛋白质如胰蛋白酶、内肽酶Arg-C、内肽酶Lys-C、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶中的一种或二种以上，变性剂为尿素、盐酸胍、SDS中的一种；还原剂为二硫苏糖醇(DTT)、磷酸三氯乙酯(TCEP)、β-巯基乙醇中的一种；烷基化试剂为碘代乙酸、碘乙酰胺中的一种。 1、双通道SPE的制作过程:用裁纸刀将SPE管分隔成两等份或者直接塑成两等份，在通道的底端加上筛板，通道中间以不防水防有机溶剂的薄片作为隔离板，密封后填充色谱填料，如图1所示。 2、蛋白质样品处理过程:在两通道内各加入溶于变性剂的蛋白质并加入终浓度为1mM的DTT，在室温反应lh，然后加入DTT化学计量2倍的IAA避光反应30min，然后用缓冲液稀释10倍后，按照1:20 (酶/蛋白，w/w)加入蛋白酶，室温反应l_3h，在两个通道内分别加入标记试剂，通过重力作用流过SPE，随后用流动相中平衡缓冲液冲洗两个SPE通道，最后用流动相中的洗脱缓冲液洗脱并收集馏分。 本专利技术具有如下优点: 1.双通道SPE柱制备简单。将SPE分隔成两等份，加上隔板并密封即可。 2.操作简便。样品预处理的全过程，只需要向SPE的两个通道加入蛋白和反应试剂即可。 3.高回收率。采用色谱填料，可保证蛋白质样品在不同的反应过程中在色谱填料上的保留，避免处理过程中引起样品损失。此外，整个样品预处理过程均在SPE内原位进行，避免了转移、试管内壁吸附等造成的损失，回收率高(图2)，无需混合，避免样品转移时取出体积不等导致定量结果与理论值不符。 4.高准确度和高精密度定量。实现了复杂样品的定量分析，由于原位操作，样品平行处理并且损失少，蛋白质定量结果与理论值符合较好，分析的重现性良好。 【附图说明】 图1双通道SPE结构示意图；1:双通道SPE的中间隔板，2:双通道SPE的两个通道，3:色谱填料，4:筛板，5:流出液出口 ； 图2双通道SPE标记效率考察； 图3SPE回收率考察； 图4实际样品经双通道SPE本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双通道SPE柱，其特征在于：包括上端开口、下端密闭的横截面直径为50μm‑5cm的圆柱或圆锥形容器,于容器内部的密闭端处设有柱塞或筛板；沿容器内部轴向设有一隔板，隔板将容器的内部空腔分隔成左右体积相同的两等份，形成两个通道；密封后向两个通道内填充等质等量的色谱填料；于密闭端设有流出液出口，流出液出口的中心轴线处于隔板上。
【技术特征摘要】
1.一种双通道SPE柱，其特征在于: 包括上端开口、下端密闭的横截面直径为50 μ m-5cm的圆柱或圆锥形容器，于容器内部的密闭端处设有柱塞或筛板；沿容器内部轴向设有一隔板，隔板将容器的内部空腔分隔成左右体积相同的两等份，形成两个通道；密封后向两个通道内填充等质等量的色谱填料；于密闭端设有流出液出口，流出液出口的中心轴线处于隔板上。2.根据权利要求1所述的双通道SPE柱，其特征在于:容器包括:20-5000μ L移液器枪头，l-20ml固相萃取(SPE)管，l-20ml注射器针管中的一种。3.根据权利要求1所述的双通道SPE柱，其特征在于:所述柱塞可以是在柱管内原位合成的整体柱柱塞；筛板为其上设有孔径为3ηπι-20μπι通孔的筛板。4.根据权利要求1所述的双通道SPE柱，其特征在于: 同一 SPE的两通道内的填料可以是反相填料或者离子交换填料； 反相填料包括:C18反相填料、CS反相填料、C4反相填料中的一种，粒径为1.7 μ m.-100 μ m ;离子交换填料包括:SCX填料和WCX填料中的一种；填料形态包括:颗粒型材料或整体材料。5.根据权利要求1所述的双通道SPE柱，其特征在于: 于流出液出口远离容器侧设有中空的圆管，圆管通过流出液出口分别与两个互不连通通道相连通，隔板与柱 塞或筛板密闭连接，隔板与容器内壁密闭连接；所述隔板为聚四氟乙烯箔片或其他防水防有机溶剂的塑料箔片。6.一种权利要求1所述双通道SPE柱在定量蛋白质组学的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:用于蛋白质样品处理过程；1)在SPE柱的两个通道内分别加入100 μ L变性剂溶液(如8Μ尿素，6Μ盐酸胍或1%SDS等)溶解的1-1OOOyg的蛋白质，随后加入还原剂使终浓度为1mM (二硫苏糖醇(DTT)、磷酸三氯乙酯(TCEP)，或β-巯基乙醇等)进行蛋白质的还原，随后加入烷基化试剂使终浓度为55mM (碘代乙酸或碘乙酰胺)进行蛋白质的烷基化处理，用缓冲盐溶液将变性剂浓度稀释10倍后，按照蛋白:酶=50...
【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，周愿，赵群，张珅，杨开广，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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