一种IgA1酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种制备IgA1酶的方法，包括以下步骤：1)以细菌作为发酵菌株，发酵完成后，得到发酵液；所述的细菌为淋球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌或变异链球菌；2)分离纯化发酵液，得IgA1酶。本发明专利技术提供的IgA1酶在模型小鼠体内对IgA1及含IgA1免疫复合物有显著的分解效果，并且效果明显好于商品化IgA1酶，为IgAN的临床治疗提供了一种和药物筛选提供重要参考。

【技术实现步骤摘要】
—种IgAI酶及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种酶，特别是IgAl酶及其制备方法，以及其在制备治疗IgA肾病的药物中的应用。
技术介绍
IgA肾病(IgAN)是全球范围内最为常见的原发性肾小球疾病，大约25%~50%的患者在疾病诊断后25年内发展到终末期肾衰竭(ESRD);患者即使接受肾移植，仍有超过50%的患者在肾移植术后两年内IgAN复发。因此，对IgAN的发病机制及其防治研究具有重要的临床价值和社会意义。 现有研究表明，IgAN作为一种自身免疫性疾病，是以IgA或以IgA为主的免疫球蛋白在肾小球系膜区及毛细血管袢呈弥漫颗粒状或团块状沉积所引起一系列临床及病理改变。半乳糖缺失的IgA暴露其铰链区抗原决定簇，使得针对异常IgA的自身IgG和IgA抗体产生，形成的免疫复合物沉积于系膜区，激活系膜细胞及补体系统导致肾脏损伤。 目前，在原治疗基础上从自身免疫发病机制角度出发，探索新的IgAN治疗思路成为了研究热点。现有研究发现(IgAl蛋白酶的生物学作用，生物医学工程学杂志，2011年4月第28卷第2期，张紫媛等，P423-427)，一些微生物因其产生IgA酶对人类有致病性，但是由于IgA酶能够降解IgA分子,使得研究人员希望使用IgA酶来对IgAN进行治疗。不过，由于缺乏可靠的动物模型，这个领域的研究主要集中在体外实验上，IgA酶是否能够有潜在的治疗用途还不能客观的评价。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，本专利技术的一个方面是提供一种制备IgAl酶的制备方法，它包括以下步骤: I)以细菌作为发酵菌株，发酵完成后，得到发酵液；所述的细菌为淋球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌或变异链球菌； 2)分离纯化发酵液，得IgAl酶。 优选的，所述的细菌为淋球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌。 进一步优选的，所述淋球菌为菌株号为ATCC49226的菌株；所述流感嗜血杆菌为菌株号为ATCC49247或ATCC10211的菌株；所述肺炎链球菌为菌株号为ATCC_? 6303?(血清3型)的菌株；脑膜炎球菌为菌株号为ATCC13090的菌株。 更优选的细菌为淋球菌，其菌株号为ATCC49226 ;或者为流感嗜血杆菌，其菌株号为 ATCC49247。 最优选的细菌为流感嗜血杆菌，其菌株号为ATCC49247。 本专利技术所述制备IgAl酶的方法中，步骤I)中所述的发酵方法是: 将细菌复苏后接种于液体培养基中，置37°C 200r/min震荡培养18h，使菌悬液的光吸收值A600为1.0 ； 将菌悬液以体积比10%的比例接种于液体培养基中，37°C 200r/min震荡培养15-24h后，离心，收集上清液备用； 步骤2)中所述的分离纯化方法是: 取步骤I)得到的上清液，在4°C搅拌条件下加入饱和硫酸铵(NH4)2SO4至终浓度为50%，之后静置2h，于4°C离心，收集沉淀，用Tris-HCl缓冲液溶解，即获得IgA蛋白酶粗制品，透析、浓缩后即得。 本专利技术的另一个目的是提供一种IgAl酶，其最适作用温度为35_45°C ;最适作用PH值为6-10 ;其底物为正常糖基化或异常糖基化的IgAl ；PMSF和SDS可完全抑制IgAl酶活性，DTT和EDTA则无影响；Cu2+、Ni2+、Zn2+、Fe3+和Fe2+均可抑制IgAl酶的活性，Ca2+和Mg2+对酶活性影响不明显，而Co2+、Mn2+和Al3+对不同菌种分泌的酶活性影响存在差异性；IgAl酶对底物IgAl的分解作用不受其低糖基化程度的影响。 并且它是由权利要求1~6任意一项所述的方法制备的。 本专利技术的再一方面是提供所述的IgAl酶在制备治疗IgAN的药物中的用途。 在一个具体的实施例中，本专利技术制备了稳定的动物模型，制备方法简单，能够用于评价本专利技术的IgAl酶对沉积于肾组织中的免疫复合物的消化能力。 在一个具体的实施例中，采用商品化的IgAl酶和从流感嗜血杆菌ATCC49247中提取的IgAl酶注射到动物模型中，评价不同的IgAl酶对体内IgAl的消化能力。 显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。 【附图说明】 图1 IgA患者血清中Jacalin结合蛋白的SDS-PAGE电泳: 1.1gAl标准品；2.稀释血清；3.50 %饱和(MM)2SO4沉淀；4.Jacalin穿透液； 5.PBS流出液；6.蜜二糖洗脱液I ;7.蜜二糖洗脱液2 ；8.蜜二糖洗脱液3 ；9.蜜二糖洗脱浓缩液 图2 Western blot鉴定提取的IgAl蛋白: 1.1gA患者血清；2.过Jacalin纯化柱穿透液；3.PBS流出液；4.过Jacalin柱蜜二糖洗脱液；5.PBS流出液；6-9.过S^hadex G-200分子筛层析流出液 图3 Jacalin结合蛋白过Sephadex G-200分子筛层析: 第I峰为plgA，第2峰为mlgA，第3峰为非IgA峰 图4 IgAl蛋白过Sephadex G-200分子筛层析: 第I 峰为 plgAl，第 2 峰为 mlgAl 图5-1商品化的IgAl形成的免疫复合物I的免疫荧光观察图 图5-2 IgAN患者血清中提取的低糖基化IgAl形成的免疫复合物2的免疫荧光观察图 图5-3阴性对照组的免疫荧光观察图 图5-4同源对照组的免疫荧光观察图 图6 ELISA法检测不同菌种分泌的IgAl酶活性 图7-1低糖基化IgAl形成的免疫复合物与NaCl (对照)作用后的免疫荧光观察图 图7-2低糖基化IgAl形成的免疫复合物与提取自流感嗜血杆菌ATCC49247的IgAl酶作用后的免疫荧光观察图 图7-3商品化IgAl形成的免疫复合物与NaCl (对照)作用后的免疫荧光观察图 图7-4商品化IgAl形成的免疫复合物与商品化的IgAl酶作用后的免疫荧光观察图 图5-1至图5-4，以及图7-1至图7-4中，图a为荧光抗体2:检测IgAl的Fe段；图b为荧光抗体1:检测IgAl的F(ab)段；图(:为荧光抗体3:检测羊抗人抗体的F(ab)段，即免疫复合物中的IgAl的Fab段。 【具体实施方式】 用于形成免疫复合物的抗原: 抗原1:购买商品化的人多发性骨髓瘤血衆IgAl, Myeloma (Fitzgrald公司) 抗原2:从IgAN患者血清中提取的低糖基化IgAl 用于形成免疫复合物的抗体: 抗体1:AffiniPure F (ab，)2Fragment Goat Ant1-Human IgG, F (ab，)2FragmentSpecific (Jackson 公司)为特异抗 IgAl 的 IgG 抗体2:ChromPure Goat IgG.F(ab’)2Fragment (Jackson 公司)，为非特异抗 IgAl的普通的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备IgA1酶的方法，包括以下步骤：1)以细菌作为发酵菌株，发酵完成后，得到发酵液；所述的细菌为淋球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌或变异链球菌；2)分离纯化发酵液，得IgA1酶。

【技术特征摘要】
1.一种制备IgAl酶的方法，包括以下步骤: 1)以细菌作为发酵菌株，发酵完成后，得到发酵液；所述的细菌为淋球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌或变异链球菌； 2)分离纯化发酵液，得IgAl酶。2.根据权利要求1所述的制备IgAl酶的方法，其特征是:所述的细菌为淋球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌。3.根据权利要求1~2任一一项所述的制备IgAl酶的方法，其特征是:所述淋球菌为菌株号为ATCC49226的菌株；所述流感嗜血杆菌为菌株号为ATCC49247或ATCC10211的菌株；所述肺炎链球菌为菌株号为ATCC? 6303?(血清3型)的菌株；脑膜炎球菌为菌株号为ATCC13090的菌株。4.根据权利要求3所述的制备IgAl酶的方法，其特征是:所述的细菌为淋球菌，其菌株号为ATCC49226 ;或者为流感嗜血杆菌，其菌株号为ATCC49247。5.根据权利要求4所述的制备IgAl酶的方法，其特征是:所述的细菌为流感嗜血杆菌，其菌株号为ATCC49247。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊均明，王丽，文集，李雪英，
申请(专利权)人：樊均明，
类型：发明
国别省市：四川;51