本发明专利技术涉及猪轮状病毒ΔVP8亚单位重组嵌合蛋白及其应用，所述重组嵌合蛋白是由破伤风毒素T细胞表位多肽P2以及猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式（Gottfried-ΔVP8）和猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式（OSU-ΔVP8）嵌合而成，且在破伤风毒素T细胞表位多肽P2、Gottfried-ΔVP8和OSU-ΔVP8之间通过柔性Linker连接，有助于重组嵌合蛋白的正确折叠，提高可溶性蛋白产量。本发明专利技术提供的猪轮状病毒ΔVP8亚单位重组嵌合蛋白可诱导高滴度的抗类Gottfried型(G4P[6])或类OSU型(G5P[7]基因型特异的轮状病毒中和抗体，表明该重组嵌合蛋白具有优良的免疫原性，且该可溶性重组嵌合蛋白的产量高（实验室常规制备可达20mg/L以上），适合于工业化生产以及大批量新型猪轮状病毒疫苗的制备。
【技术实现步骤摘要】
猪轮状病毒ΔνΡ8亚单位重组嵌合蛋白及其应用
本专利技术属于分子生物学和基因工程领，具体地说，涉及猪轮状病毒AVP8亚单位重组嵌合蛋白及其应用。
技术介绍
轮状病毒性胃肠炎也称轮状病毒性腹泻，是全世界范围内婴幼儿及多种幼龄动物腹泻的最主要的急性肠道传染病，以腹泻和脱水为特征，死亡率高，给人类健康和畜牧业发展造成巨大危害。 仔猪轮状病毒腹泻是由猪轮状病毒(Procine Rotavirus，PRV)引起的一种以腹泻、厌食、呕吐、脱水为特征的急性传染病，多发生于寒冷季节即晚秋、冬季和早春，各种年龄的猪皆可感染，感染率最高可达90%~100%。并且本病易继发细菌性感染，令仔猪死亡率升高，从而造成严重的经济损失。1975年Woode和Bridge在英国首次报道PRV，随后PRV在猪群中的传播引起了许多国家的重视，美国、法国、澳大利亚、北爱尔兰等均有RV引起仔猪腹泻的相关报道。数据显示，美国断奶仔猪感染阳性率为80%，病死率为15%;当有混合感染时，病死率更高。英国报道I~4周龄仔猪的发病率超过80%，病死率10%~30%，发病猪体重急剧下降10%~20%，需半个月甚至更长时间才能回复到正常生长速度，由此可见仔猪轮状病毒腹泻可给养猪业带来巨大的经济损失。RV在猪群中普遍存在，波兰人Markowska-Daniel等在11个大型猪场里，从2~10周龄的腹泻仔猪群中(断乳前发病率为8%~15%)采集了 1230份血清和531份粪样，进行RV抗体检测及病毒分离，ELISA检测结果显示有1214份血清为RV抗体阳性，169个粪样为抗原阳性；Barman等对采自印度Assam地区的528份猪血清样品进行了间接ELISA检测，其中RV阳性率占51.1%，明显高于TGEV (猪传染性胃肠炎病毒，39.4%)和PEDV (猪流行性腹泻病毒，21.2%)。加拿大人Dewey等研究了猪A群轮状病毒感染比率与饲养规模管理之间的关系，发现饲养规模大且断奶较早的仔猪群易感染A群RV ;集约化生产模式下饲养的仔猪A群RV阳性感染率比持续流动设施条件下大约高3.4倍。 我国在1982年首次从腹泻猪粪便中分离到轮状病毒。1990年王玉春等对国内19个省共计121个猪场做血清学调查，未发现RV阴性猪群。1999年李国平等在调查中发现I~10日龄仔猪RV阳性率在42.4%~66%之间，10日龄到断奶仔猪RV阳性率则高达83.2%~91.7%，断奶后仔猪RV阳性率为63.2%~72%。程健频等在2002年10月对甘肃省庄浪县7个乡镇90户饲养的2100头仔猪进行了初步调查，感染RV并发病的仔猪有1460头，发病率达69.5%，其中因环境温度下降，继发大肠埃希菌病死亡690头，死亡率47.8%。2003年冬季至2004年春季，在上海的一些规模化猪场中，生产母猪虽然已按程序进行了猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联苗免疫，但其产下的仔猪仍发生病毒性腹泻，经诊断为猪RV感染，造成了巨大的经济损失。2011年12月16至17日，湖南省平江县三阳乡的四个中等规模猪场的仔猪相继发生一种以厌食、呕吐、腹泻为主要症状的疾病，经诊断亦为RV感染，发病率为100%，因采取措施及时得当，死亡率为10.3%。目前，我国规模化、集约化养猪已占相当大的比重，2012年生猪存栏47492万头，而大部分猪群都未进行RV免疫接种，处于免疫空白状态，造成易感猪群广泛存在，为轮状病毒感染留下了极大隐患。 PRV经粪-口途径在猪群中传播，病猪、隐性感染猪以及带毒猪是主要的传染源，病毒粒子主要存在于它们的消化道中，随粪便排到体外，污染饲料、饮水、垫草及土壤等，经消化道途径使易感猪感染。排毒时间可持续数天，加之病毒对外界环境抵抗力较强，使轮状病毒在成年猪、中猪、仔猪之间反复循环感染，长期扎根猪场。另外，人和其他动物也可散播传染。在流行地区，由于大多数成年猪呈隐性感染而获得对病毒的免疫力，因此，发病猪多是8周龄以下的仔猪，日龄越小的仔猪，发病率越高，I~4周龄仔猪发病率超过80%。该病主要表现为腹泻症状，发病仔猪粪便为水样或糊状，严重者带有粘液和血液。若继发或并发其他细菌性或病毒性疾病，极易导致高死亡率。中猪和大猪呈隐性感染，无临床症状。 RV主要入侵小肠绒毛上皮细胞，其次是盲肠和结肠上皮细胞。幼畜感染RV后，很快便会发生胃壁迟缓，小肠绒毛萎缩、上皮细胞脱落，肠道分泌和吸收功能失调，致使肠内容物渗透压增高，正常的离子和水分即向肠腔分泌，最终导致渗透性腹泻。眼观病变主要局限于消化道，小肠黏膜呈条状或弥散性出血，肠壁变薄且肠粘膜易脱落。 目前我国较大规模临床应用的包括福建省生物药品厂与中国农业大学联合开发的TGEV-PEDV-RV三联弱毒苗，以及中国农科院哈尔滨兽医研究所研制的RV-TGEV 二联弱毒苗等。弱毒疫苗虽然克服了灭活疫苗固有的一些缺陷，但由于致弱毒株毒力不稳定，存在着病毒污染、毒力返强、疫苗株与流行株共存可能产生强毒株，疫苗基因重配后可能扩大感染宿主等不安全因素，给养猪业的安全生产带来了极高风险。我国猪群的RV阳性率非常高，至今还没有治疗猪轮状病毒腹泻的特效药物，疫苗接种是预防该病的主要措施。国内猪RV疫苗的研究一直是薄弱环节，而现有疫苗对于控制该病的发生和流行并不十分理想，因此开发廉价、安全、有效的轮状病毒新型疫苗是具有十分重要的意义。 轮状病毒(Rotavirus, RV)为呼肠弧病毒属(Reoviridae)成员，病毒基因组由11节段dsRNA组成，编码6个结构蛋白(VPl~4，VP6~7)和6个非结构蛋白(NSP1~6)。成熟的病毒粒子为三层衣壳结构，最外层由纤突蛋白VP4 (经蛋白酶裂解形成VP8和VP5)和糖蛋白VP7组成。VP7与病毒在富含蛋白酶的成熟的小肠上皮细胞中复制直接相关。VP4蛋白不仅涉及RV的粘附、侵入，而且与RV血凝性、中和活性、毒力以及蛋白酶裂解后感染性增强等理化特性相关。VP7和VP4都可独立的诱导病毒中和抗体，抗VP7和VP4的抗体都可阻止病毒的侵入。因此，VP7和VP4成为疫苗开发的首选目标分子。 轮状病毒基因型别组合众多，不同基因型间的交叉免疫甚少，这给疫苗研制带来了困难。然而，研究发现一个P基因型可能覆盖数个G基因型，即某个P型可以与不同的G型组合，理论上同一 P型可以诱导抗不同G型的异型免疫。而决定P型的VP4蛋白含有多个线性化抗原表位，且该蛋白无需翻译后修饰，其经胰酶裂解后形成的VP8片段，包含了 VP4型特异性主要抗原表位，皆为线性且较为保守，可以利用VP8蛋白来开发新型的PRV亚单位疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪轮状病毒AVP8亚单位重组嵌合蛋白及其应用。 为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种猪轮状病毒Λ VP8亚单位重组嵌合蛋白，其是由破伤风毒素T细胞表位多肽P2以及猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式(以Gottfried- Λ VP8表示)和猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式(以OSU- Δ VP8表示)嵌合而成的重组蛋白，且在破伤风毒素T细胞表位多肽P2、Gottfried- Δ VP8和OSU- Δ VP8之间通过柔性Linker连接，有助本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪轮状病毒ΔVP8亚单位重组嵌合蛋白，其特征在于，其是由破伤风毒素T细胞表位多肽P2以及猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式和猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式嵌合而成的重组蛋白，且在破伤风毒素T细胞表位多肽P2、猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式和猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式之间通过柔性Linker连接；其中，所述破伤风毒素T细胞表位多肽P2、猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式以及所述猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式的氨基酸序列分别如SEQ ID No.7‑9所示。
【技术特征摘要】
1.猪轮状病毒AVP8亚单位重组嵌合蛋白，其特征在于，其是由破伤风毒素T细胞表位多肽P2以及猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式和猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式嵌合而成的重组蛋白，且在破伤风毒素T细胞表位多肽P2、猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式和猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式之间通过柔性Linker连接； 其中，所述破伤风毒素T细胞表位多肽P2、猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式以及所述猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式的氨基酸序列分别如SEQ IDN0.7-9 所示。2.根据权利要求1所述的重组嵌合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。3.编码权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：闻晓波，张艳，冉旭华，魏晓曼，崔玉东，朱战波，张春山，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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