一种耐酸性提高的L-阿拉伯糖异构酶突变体制造技术

一种耐酸性提高的L-阿拉伯糖异构酶的22位突变体酶，属于酶的基因工程技术领域。本发明专利技术公开了由来源于微生物Alicyclobacillushesperidum的L-阿拉伯糖异构酶（简称Alhe-LAI酶）作为亲本，利用基因突变技术，将其22位的亮氨酸Leu替换为缬氨酸Val，获得单突变体酶L22V，其耐酸性得到提高；酶反应的最适pH由原来的7.0降至6.0；在酸性条件下，酶反应的底物D-半乳糖平衡转化率由10%提高至24%，更适于产物D-塔格糖的生成，具有重要的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种耐酸性提高的L-阿拉伯糖异构酶突变体
本专利技术公开一种耐酸性提高的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶，属于酶的基因工程
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技术介绍
D-塔格糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的功能性甜味剂。D-塔格糖属于天然稀有糖的一种，在许多食品中都发现少量存在，如高温灭菌牛奶、奶酪、酸奶及其它奶制品等。2000年美国食品与药物管理局(FDA)确定D-塔格糖为普遍公认安全食品(GRAS )，并正式批准作为甜味剂用于食品饮料业以及医药制剂中；随后JECFA(联合国粮农组织和世界卫生组织联合食品添加剂委员会)第57次会议批准D-塔格糖作为食品添加剂；欧盟也于2003年批准D-塔格糖在欧洲上市。 目前，国内对于D-塔格糖生产的研究还处于起步阶段，国外对其研究已较为深入，生产方法主要有两种:化学法和生物法。但目前市售的D-塔格糖都是由化学法生产的。由于一方面化学法生产存在许多不利因素，如化学污染物多，碱性条件下异构化反应副产物多，分离困难等；另一方面由于消费者消费观念的转变，天然食品的需求日益增长，因此近年来对D-塔格糖生产的研究集中在生物法上。研究发现L-阿拉伯糖异构酶可以催化D-半乳糖转化为D-塔格糖，是目前生物法生产D-塔格糖最为有效的途径。D-半乳糖与D-塔格糖之间异构反应的平衡受温度影响很大，较高温条件下(60°C以上)更有利于D-塔格糖的生成，因此耐热性的L-阿拉伯糖异构酶将具有更好的应用前景。 目前，已有很多菌属被鉴定具有L-阿拉伯糖异构酶的基因(araA)，例如Mycobacterium smegmatis (J Bacter1l, 1978, 133 (I):413 - 414) > Escherichia coli(World J Microb1l B1technol, 2003, 19(1): 47 - 51) > i?.5tearothermophiIusUSlOO (B1chim B1phys Acta, 2006, 1760: 191-199) > Lactobacillus sakei 23K(B1resource Technology 101, 2010, 9171 — 9177)及 Bifidobacterium longum(B1process B1syst Eng, 2013, 36:489 - 497)等菌属均具有L-阿拉伯糖异构酶的基因，被鉴定出来具有表达L-阿拉伯糖异构酶的功能。近年来，对于L-阿拉伯糖异构酶的研究热点集中在嗜热及耐酸微生物。因为温度和酸性环境是催化反应的一个重要因素，高温及酸性环境利于D-塔格糖的合成，并减少副产物的生成。因此，为获得更适合的生物催化剂，通过定点突变的方法，对来自嗜热菌的Alhe-LAI酶进行分子改造，进一步提高其耐酸性，以期得到酶学性质更适合工业应用的Alhe-LAI酶。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种耐酸性提高的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶，对D-塔格糖的生产有重要的意义。 本专利技术的技术方案:一种耐酸性提高的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突变体酶1^22￥,将来源于47/<^^70如<^77?5.hesperidum的L-阿拉伯糖异构酶,进行突变所得的单突变体酶；将原来Alhe-LAI酶基因中第22位的亮氨酸Leu替换为缬氨酸Val，命名为L22V。 与野生型酶Alhe-LAI相比，所述Alhe-LAI的突变体酶L22V的耐酸性获得提高，酶反应的最适PH由原来的7.0降低至6.0 ;在酸性条件下，酶反应的底物D-半乳糖平衡转化率由10%提高至24%。 一种重组表达质粒，其中含有所述的Alhe-LAI的突变体酶L22V基因。 一种表达宿主，其被含有Alhe-LAI的突变体酶L22V基因的重组表达质粒转化。 所述来源于微生物hesperidum的 Alhe-LAI 基因在 GenBank 的编号为NZ_AKZN01000011.1，基因全长1497个核苷酸，见序列表中SEQ ID No:1，编码498个氨基酸，见序列表中SEQ ID No:2。 所述Alhe-LAI的突变体酶是将其22位氨基酸亮氨酸Leu突变为缬氨酸Val，命名为L22V，见序列表中SEQ ID No:4。L22V的核苷酸序列见SEQ ID No:3。 本专利技术还提供Alhe-LAI酶的突变体酶L22V的制备方法，其具体步骤为:(X)在Alicyclobacillus hesperidum的Alhe-LAI酶模拟结构的基础上确定突变位占.(2)设计定点突变的突变引物，以携带Alhe-LAI酶基因的载体为模板进行定点突变构建突变质粒 pET-22b (+) -L22V ；(3)将突变质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养;(4)离心菌体，重悬后超声破碎，阴离子交换柱纯化得到突变体L22V。 本专利技术的有益效果:本专利技术提供一种具有较好耐酸性的Alhe-LAI酶的突变体酶L22V，其最适反应pH为6.0，明显低于野生型Alhe-LAI酶的最适反应pH7.0 ;在酸性条件下，底物的平衡转化率明显提高，较适于D-塔格糖的工业化生产，在化学、食品和制药领域中具有重要的应用价值。 【附图说明】 图1突变体酶L22V与野生型Alhe-LAI相比，酶反应的最适pH由7.0降至6.0，有显著降低。 图2突变体酶L22V与野生型Alhe-LAI相比，在酸性pH条件下酶的稳定性。 图3突变体酶L22V与野生酶Alhe-LAI，突变体酶L22V对底物的转化率明显提高。 【具体实施方式】 实施例1:Alhe_LAI酶耐酸性突变体制备方法利用快速PCR定点突变的方法构建pET-22b (+) -L22V突变质粒；pET-22b (+) -L22V突变质粒的构建:以pET_22b (+)-Alhe-LAI质粒为模板，经PCRl，PCR2及PCR3，引入L22V定点突变，测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒pET-22b (+) -L22V构建成功。 突变引物如下所示:(下划线为突变点) 上游外侧引物:5’ -TTATCCATAT GGAGGATGCA AACATGCAT-3’， 下游外侧引物:5’ -TATATCTCGA GCCGATAACA CACTTCATT-3’，正向突变引物:5’ -CAGTTTGTGT ACGGGCCGGA GGT-3’，下划线为突变碱基， 反向突变引物:5’ -GCCCGTACAC AAACTGACTG C-3’，下划线为突变碱基，PCR 1:反应体系的组成:以带有L-阿拉伯糖异构酶目的基因的克隆载体pMD-araA为模版。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐酸性提高的L‑阿拉伯糖异构酶Alhe‑LAI的突变体酶L22V，其特征在于将来源于Alicyclobacillus hesperidum的L‑阿拉伯糖异构酶进行突变所得的单突变体酶；将原来Alhe‑LAI酶基因中第22位的亮氨酸Leu替换为缬氨酸Val，命名为L22V。

【技术特征摘要】
1.一种耐酸性提高的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突变体酶L22V，其特征在于将来源、号Alicyclobacillus hesperidum饱L-阿拉伯糖异构酶进行突变所得的单突变体酶；将原来Alhe-LAI酶基因中第22位的亮氨酸Leu替换为缬氨酸Val，命名为L22V。2.根据权利要求1所述的Alhe-LAI的突变体酶L22V，其特征在于与野生...

【专利技术属性】
技术研发人员：沐万孟，江波，范晨，张涛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32