一种鉴别罗汉果性别的SCAR分子标记制造技术

本发明专利技术属于植物分子生物学领域，具体涉及一种用PCR鉴定罗汉果的雌雄的方法，具体提供了罗汉果雄株的特异DNA片段序列，及PCR引物的设计，PCR条件的优化等。

【技术实现步骤摘要】
—种鉴别罗汉果性别的SCAR分子标记
本专利技术属于植物分子生物学领域，具体涉及一种鉴别罗汉果性别的SCAR分子标记的分离和确定。
技术介绍
罗汉果是一种名贵药材。中医药学认为，罗汉果甘、酸，性凉，有清热凉血、生津止咳、滑肠排毒、嫩肤益颜、润肺化痰等功效。 罗汉果为雌雄异株植物，其雌株与雄株的形态特征肉眼无法识别，只能等到开花时才能分辨雌雄。目前实际生产上应用的种苗，来源几乎都是雌株的扦插苗或者组培扩繁苗，很少使用种子繁殖的实生苗。扦插或组织培养优点是操作比较简便、见效快，但田地、人工、培养基等成本还是相对较高。而且由于现在这种大量无性繁殖的应用，使得种苗质量下降，多感染病毒及其它病害。种苗生长势弱、根系不发达、种植成活率低，成活后也多由于病毒和线虫等病虫害的发作，造成大量死苗、减产。另外过多的无性繁殖，还使得罗汉果作为我国一个稀有药用植物来说，品种愈来愈单一。相比较来说，用种子繁殖可以克服上述缺点。种子繁殖的实生苗，没有病毒病害感染，根系更加发达，植株生长健壮，产量更闻。物育种上，如果能够在幼苗期间鉴定雌雄，就可使用较多数量的实生苗作为选择的对象，其育种选优率就可大大提高，而且选择越早育种效率越高。 性别的早期识别对于实际生产中性别的调控更具意义，生产上需要大量种植雌株，但罗汉果种子中70%以上为雄株。所以生产时需要大量种植，等到开花后再把雄株人工拔去。除了占用田地外，还很费人工。对罗汉果得育种和优良品种的推广造成很大困难。如果能在幼苗阶段鉴定雌雄，可以大大减少成本。 应用本专利技术所用方法，可以在早期对罗汉果幼苗进行雌雄株鉴定，有针对性的进行实生苗生产，降低种苗生产等成本，提高种苗质量。是进行优质罗汉果种苗生产不可缺少的技术手段。 目前植物雌雄鉴定的方法有四种；1.通过外部形态特征鉴别；2.通过生理代谢差异鉴别；3.通过化学物质分析鉴别；4.通过RAH)标记鉴别雌雄株。雌雄异株植物在幼苗期难以从外部形态来预测性别，因此能进行性别的早期鉴定的可靠指标主要依赖于其内部遗传类型或生理生化来鉴别。 目前随机扩增多态性 DNA (Random amplified polymorphic DNA, RAPD)标记已广泛用于雌雄异株植物的性别鉴别研究中。秦新民等对罗汉果基因组DNA的RAPD分析结果表明，部分引物PCR扩增时雌雄株间具有多态性。并已用此种方法，获得了几个与雌雄相关的标记片段，表明了罗汉果可能存在性染色体，或者这些标记是与性别决定基因紧密连锁的。我们创造性地在随机引物序列中加入简并碱基，扩增得到了一个雄株特异片段。但由于RAPD标记不够稳定，本专利技术设计了一系列实验拟将RAPD标记转化为序列特异性扩增区(Sequence-characterized Amplified Reg1n, SCAR)标记，以便尽快应用于罗汉果早期性别的鉴定研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能鉴定罗汉果雌雄株的SCAR分子标记。 本专利技术以罗汉果雌雄株叶片为材料，用10个随机引物进行筛选，扩增反应体系及反应程序参照陈其军等人(陈其军，韩玉珍，傅永福，等.大麻性别的RAPD和SCAR分子标记[J] ?植物生理学报，2001，27( 2): 173- 178.)的方法。其中引物P7扩增得到I条雄株特异性片段。将这条差异片段回收、克隆及测序，获得的序列长度为1216bp，将其命名为Z-1200，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。 提取罗汉果雌株和雄株的基因组DNA，根据上述Z-1200所述的核苷酸序列，设计系列引物进一步确定精确的SCAR标记。设计第一套引物Z1200-F1和Z1200-R1，所述引物序列如SEQ ID N03、4所示。结果发现，用第一套SCAR标记引物进行扩增，得到的扩增结果，在罗汉果雌株和雄株间有差异。从琼脂糖凝胶电泳分析结果可以看到:第一套SCAR标记引物Z1200-F1弓丨物与Z1200-R1，扩增罗汉果基因组DNA时，所有雄株可以扩增得到648bp的目的条带。但雌雄株都可以扩增得到一背景条带，此条带比648bp目的条带略小。 为分析背景条带与目的条带间的差异，本专利技术在PCR扩增后、分别回收了雌雄株所扩增得到的各条带片段，克隆到T载体进行测序，并对结果进行分析。通过DNAMAN进行序列比对，结果是上述PCR中的目的条带与背景条带相比较，大部分序列相同，只是中间部分多出了 93碱基，如SEQ ID N0:5所示。因此，此序列才是雄株特异片段，确定此段序列是用于SCAR标记的目的片段。 根据上述实验结果，设计第二套SCAR标记引物，Z1200-F2和Z1200-R2。所述引物序列如SEQ ID N05、6所示。扩增罗汉果基因组DNA时，所有雄株可以扩增得到811bp的目的条带，条带单一、大小正确、没有背景条带干扰。 为了验证第二套SCAR标记引物，在鉴定罗汉果雌雄株方面的可靠性。我们随机从田间选取了一些已经开花的样品，编号后带回实验室。用此对引物进行雌雄株的PCR鉴定。结果是，用此引物鉴定雌雄株，结果正确带单一，结果正确、实验结果稳定、可靠。 上述结果表明，雄株所特有的93bp序列，即SEQ ID NO:2为罗汉果雄株特异的SCAR分子标记。 本专利技术的具体技术路线如图1所示。 本专利技术所提供的SCAR标记对于罗汉果的批量产业化生产，具有重大意义。 下面结合附图和实施例对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。 【附图说明】 图1是本专利技术技术路线图。 图2是用随机引物P7分别对罗汉果雌雄株进行扩增的结果，图中从左向右依次为:1-5泳道为雌性二倍体罗汉果，6-9泳道为雄性二倍体罗汉果，10-11泳道为雌性三倍体罗汉果，12泳道为雄性三倍体罗汉果，13泳道为Marker (条带自大到小依次为:5000bp ；3000bp ；2000bp ；100bp ；750bp ；500bp ；250bp ；100bp),图中箭头所指，即为特异条带扩增目的片段，大小约为1200bp。 图3是Z1200-F1引物与Z1200-R1引物扩增罗汉果基因组DNA结果电泳图，扩增目的片段大小为648bp，图中从左向右依次为:1- 7泳道为雌性单株；8-11泳道为雄性单株；12泳道为水负对照；13泳道为Marker。 图4是Z1200-F2引物与Z1200-R2引物，扩增罗汉果基因组DNA结果琼脂糖凝胶电泳图，扩增目的片段大小为811bp，图中从左向右一次为:1- 7泳道为雌性单株；8-11泳道为雄性单株；12泳道为水负对照；13泳道为Marker。 图5为SCAR标记引物Z1200-F2和Z120-R2对田间随机样品的雌雄鉴定结果。 专利技术详细描述下面详细描述本专利技术的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。 本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。 除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本专利技术所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。 本专利技术提出了一种鉴别罗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种区分罗汉果雌雄株的方法，其特征在于：所述方法包括利用罗汉果雄株所特有的SCAR分子标记进行鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种区分罗汉果雌雄株的方法，其特征在于:所述方法包括利用罗汉果雄株所特有的SCAR分子标记进行鉴定。2.权利要求1所述的方法，其中所述的SCAR分子标记的核苷酸序列如SEQID N0:5所/Jn ο3.—种区分罗汉果雌雄株的PCR方法，其特征在于所述PCR方法所获得的罗汉果雄株的扩增产物包含部分或全部的如SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。4.一种区分罗汉果雌雄株的方法，所述方法包括以下步骤: a)提取罗汉果的基因组DNA; b)设计引物，所述引物可以特异性扩增出罗汉果雄株所特有的部分或全部序列； c)进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物； d)检测所述PCR扩增产物； 其特征在于，所述引物的核苷酸序列选自SEQ ID N0:5或2或与其互补的核苷酸序列。5.一种区分罗汉果雌雄株的方法，所述方法包括将包含DNA的样品与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严谨杂交条件下，可以特异性鉴定出罗汉果雌株和雄株，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张会新，张继贤，
申请(专利权)人：北京泰朗嘉懋科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11