本发明专利技术提供了一种用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，以红豆杉种子为外植体，经灭菌、接种后，再经二次灭菌，培养一段时间后，挑取种子周围的内生真菌，置于PDA固体培养基进行培养，然后挑取部分菌斑置于PDA液体培养。用纱布过滤发酵物，将滤液部分用乙酸乙酯萃取。过滤后用旋转蒸发器在35℃下减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，得到含有紫杉醇的甲醇溶液。本发明专利技术应用真菌培养技术克服红豆杉植株生长缓慢、紫杉醇化学合成复杂的问题，为进行工厂化真菌发酵生产紫杉醇提供基础，环境友好，原料丰富，可很好缓解市场对紫杉醇供应缺口大的问题。
【技术实现步骤摘要】
—种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法
本专利技术涉及紫杉醇的产生，特别是一种通过红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法。
技术介绍
紫杉醇(Taxol),是从红豆杉属(Taxus spp.)植物中分离得到的一种具有独特抗癌作用的二萜类化合物，具有很高的开发利用价值，是目前世界主流的抗癌药物之一。化学名称:5 β , 20-环氧-1,2α , 4, 7 β , 10 β ,13α- TK羟基紫杉烧 _11_ 稀 _9~ 丽-4,10- 二乙酸酯-2-苯甲酸酯_13[ (2’R，3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]。化学式为C47H51NO14,分子量是853.92，白色结晶体粉末，无臭，无味，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂，熔点213~216°C。1967年美国北卡罗莱纳州三角研究所的Wall博士和Wani博士发现了紫杉醇。进一步研究发现紫杉醇能与微管紧密地结合，是已知的第一种能和微管蛋白聚合体相互作用从而抑制细胞有丝分裂的药物。美国国家癌症研究所和约翰霍普金斯大学医学院大量临床研究的数据表明，紫杉醇在治疗卵巢癌和乳腺癌方面效果显著。 1992年12月，美国国家食品与药品管理中心正式批准:紫杉醇为晚期卵巢癌的治疗药物。随后又批准用于治疗乳腺癌。目前紫杉醇是最好的治疗卵巢癌和乳腺癌的药物，价格非常昂贵，市场售价为4800美元/克。1994年紫杉醇创世界抗癌药物全球销量冠军。2000年紫杉醇销量创百亿(后受原料供应未有进一步上升)，但由于野生红豆杉资源濒危，2002年中央发文严禁砍伐野生红豆杉，鼓励人工种植。今天，紫杉醇已经被成功地用于对多种恶性肿瘤的治疗(包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、卡波氏肉瘤等)。 但是紫杉醇的自然资源一红豆杉和东非罗汉松(1999年测知含紫杉醇)数量有限且生长地十分缓慢。且其中有效成分的含量非常低(每公斤树皮仅能提取0.1g紫杉醇粗品)。最初，用于治疗的紫杉醇都来源于太平洋红豆杉，治疗一个病人需要6棵百年树龄的红豆杉。尽管现在紫杉醇以及它的抗癌同源衍生物可以通过其前体进行化学半合成制得。但是部分前体还需要从红豆杉中分离得到，产量受到制约。 目前，生产紫杉醇原料药有以下几种途径:①直接从红豆杉树皮或整株红豆杉植株中提取；②半合成法，即先从红豆杉中提取10-DAB等中间体，再经合成为紫杉醇成品；③培养能产生紫杉醇的红豆杉细胞；④全合成法，但由于步骤多，成本高尚未投入生产?’⑤发酵法:培养寄生在红豆杉树木身上的某些真菌来获取紫杉醇。其中发酵法属于“环境友好型”工艺，利用来源丰富的淀粉类原料，属于绿色农产品原料。而且对环境无污染，科学家普遍认为，真菌发酵法生产紫杉醇代表着紫杉醇生产的未来方向。
技术实现思路
针对紫杉醇原料药市场缺口较大的问题，本专利技术目的是提供一种通过红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法。 本专利技术的技术方案是:，以红豆杉种子为外植体,经灭菌、接种、二次灭菌、接种，诱导红豆杉种子内生菌，再培养红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法。 前面所述的方法，优选的方案在于:步骤如下:A、外植体的选择和灭菌处理:以‘曼地亚’红豆杉(Taxusmedia)种子为外植体，以洗洁精浸泡，摇床100-150转摇15-20分钟，再用清水冲洗，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1%的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗，备用；B、外植体接种:将经过步骤A中准备的外植体种子，接种在含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，培养，至在种子周围有菌丝形成；C、二次灭菌:将步骤B中得到的种子用0.1%氯化汞二次灭菌，无菌水冲洗7-8次；D、内生菌的诱导:将经过步骤C中得到的外植体种子，继续培养于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，至出现红豆杉种子内生菌；E、内生菌培养:将步骤D中得到的红豆杉种子内生菌置于PDA固体培养基进行培养，培养3天后再挑取部分菌斑置于PDA液体培养基中培养，培养3天后检测紫杉醇含量；F、紫杉醇提取:将步骤E中的发酵物用纱布过滤，将滤液部分用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取I次，收集有机相，菌丝部分经液氮研碎，超声处理，静置过夜后用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，重复处理I次，将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35°C下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体用溶解于少量甲醇中，滤膜过滤，定容至1mL备用；G、紫杉醇提取含量检测:经HPLC检测，真菌产生的发酵物中含有紫杉醇，平均含量为0.315mg/L。 前面所述的方法，优选的方案在于:所述的红豆杉为红豆杉科红豆杉属植物‘曼地亚，红豆杉(Taxus media)。 前面所述的方法，优选的方案在于:步骤A、外植体的选择和灭菌处理时:所用洗洁精浓度为2%~3%，浸泡和冲洗时间为15-30分钟，0.1%的氯化汞浸泡灭菌时间为9-14分钟，无菌去离子水冲洗次数为6-8次。 前面所述的方法，优选的方案在于:步骤B、外植体接种时:培养时间为3-5天。 前面所述的方法，优选的方案在于:步骤C、二次灭菌时:二次灭菌时间为8_12min，无菌水冲洗6_8次。 前面所述的方法，优选的方案在于:步骤D、内生菌的诱导时:培养温度为21±2°C，光照强度为1600Lux，光照时间为14小时，培养时间为7_10天。 前面所述的方法，优选的方案在于:步骤E、内生菌培养:液体培养时，每个三角瓶的接种量为2%，装液量为200mL / 500mL，摇床培养，培养温度为27°C，转速为150r /min。 前面所述的方法，优选的方案在于:步骤F、紫杉醇提取:超声处理时间为25-35min,滤膜过滤时用0.45 μ m滤膜。 前面所述的方法，优选的方案在于:步骤G、紫杉醇提取含量检测:色谱条件为:C18 柱:250mmX46mm ;流动相，甲醇:水(v/v) =60:40 ;压力:1506PSI=10.39MPa ;保护压力=10LO-Pr ;流速 0.7mL/ min，检测波长 228nm，灵敏度，0.1AUf S，柱温 35。。。 本专利技术提供的是一种利用红豆杉种子内生真菌产生紫杉醇的方法，以曼地亚红豆杉种子为材料，经75%酒精杀毒，0.1%氯化汞灭菌处理，置于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中。培养3天后，0.1%氯化汞二次灭菌，继续培养于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中。培养7天后，分离种子周围长出的真菌，置于PDA固体培养基进行培养，然后挑取部分菌斑置于PDA液体培养。用纱布过滤发酵物，将滤液部分用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相。取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取I次，收集有机相。菌丝部分经液氮研碎，超声30min，静置过夜后用等体积的乙酸乙酯萃取，重复处理I次，收集有机相。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35°C下减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，用0.45 μ m滤膜过滤，定容至5mL备用。经HPLC检测，真菌产生的发酵物中含有紫杉醇，平均含量为0.315mg/L。 具体包括下列步骤:A)以‘曼地亚本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，其特征在于：以红豆杉种子为外植体，经灭菌、接种、二次灭菌、接种，诱导产生红豆杉种子内生菌，再培养红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法。
【技术特征摘要】
1.一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，其特征在于:以红豆杉种子为外植体，经灭菌、接种、二次灭菌、接种，诱导产生红豆杉种子内生菌，再培养红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤如下: A、外植体的选择和灭菌处理:以‘曼地亚’红豆杉(Taxusmedia)种子为外植体，以洗洁精浸泡，摇床100-150转摇15-20分钟，再用清水冲洗，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1%的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗，备用； B、外植体接种:将经过步骤A中准备的外植体种子，接种在含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，培养，至在种子周围有菌丝形成； C、二次灭菌:将步骤B中得到的种子用0.1%氯化汞二次灭菌，无菌水冲洗； D、内生菌的诱导:将经过步骤C中得到的外植体种子，继续培养于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，至出现红豆杉种子内生菌； E、内生菌培养:将步骤D中得到的红豆杉种子内生菌置于PDA固体培养基进行培养，然后再挑取部分菌斑置于PDA液体培养基中培养，培养3天后检测紫杉醇含量； F、紫杉醇提取:将步骤E中的发酵物用纱布过滤，将滤液部分用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取I次，收集有机相，菌丝部分经液氮研碎，超声处理，静置过夜后用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，重复处理I次，将所有的乙酸乙酯萃取 液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35°C下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体用溶解于少量甲醇中，滤膜过滤，定容至1mL备用...
【专利技术属性】
技术研发人员：穆红梅，
申请(专利权)人：聊城大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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