本发明专利技术属于农业生物技术蛋白检测领域的检测技术，公开了一种稻飞虱血淋巴内病毒蛋白的免疫荧光标记检测方法，可用于检测稻飞虱传播的病毒在其血淋巴内的分布。本发明专利技术可对稻飞虱的血淋巴直接进行免疫荧光标记检测病毒的分布，从而用于分析病毒在稻飞虱体血淋巴内的侵染。该方法通过对稻飞虱血淋巴的抽取，并对抽取到的血淋巴吸附在经多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上，经固定、渗透、抗体孵育、制片和观察，从而检测稻飞虱血淋巴内的病毒。本发明专利技术解决了常规RT-PCR无法检测稻飞虱血淋巴内病毒的难题，使稻飞虱体内微量的血淋巴可通过免疫荧光标记技术直观准确地检测侵入其中的病毒。
【技术实现步骤摘要】
—种稻飞虱血淋巴内病毒蛋白的免疫荧光标记检测方法
本专利技术属于农业生物技术蛋白检测领域的检测技术，具体涉及。
技术介绍
水稻是我国的第一大粮食作物，然而，近年来由介体稻飞虱传播的水稻病毒病在我国南方稻区大面积发生，已成为水稻生产上最严重的病害，严重威胁到我国的粮食生产。 目前主要存在的可作为介体昆虫的稻飞虱有白背飞虱、灰飞虱和褐飞虱，其中白背飞風传播南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black streaked dwarf virus,SRBSDV),灰飞風传播水稻黑条矮缩病毒(TPice black streaked dwarf virus, RBSDV)和水稻条纹病毒(沿ce stripe virus, RSV),褐飞風传播水稻齿叶矮缩病毒(TPice raggedstunt virus, RRSV)和水稻草状矮缩病毒(TPicevirus, RGSV)? 这些稻飞虱均以持久增殖型方式传播水稻病毒。不同稻飞虱在其所传播病毒感染的水稻病株上取食后，病毒通过稻飞虱的口针进入消化道系统，首先侵染中肠上皮细胞，然后扩散到其他器官和中肠以外的血淋巴，随后从血淋巴扩散到唾液腺。一旦病毒扩散到稻飞虱的唾液腺并增殖，病毒即可在昆虫取食时随唾液传播到健康水稻。 正是由于稻飞虱是水稻病毒扩散和流行暴发的唯一传播途径，因此研究病毒在稻飞虱体内侵染和扩散的机理将为阻断稻飞虱传播水稻病毒奠定理论基础。水稻病毒在稻飞虱体内扩散到血淋巴是能否到达唾液腺的重要前提，而稻飞虱的个体小，血淋巴更少，如果要检测病毒是否扩散到血淋巴以及扩散到血淋巴的比例，则单头稻飞虱无法获得适量的血淋巴，以满足RNA的提取和后续RT-PCR检测病毒。因此需要建立一种有效的检测方法，可以对微量的血淋巴进行检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，可用于检测稻飞虱传播的病毒在其血淋巴内的分布。本专利技术可对稻飞虱的血淋巴直接进行免疫突光标记检测病毒的分布，从而用于分析病毒在稻飞風体血淋巴内的侵染。 为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案:，是通过对稻飞虱血淋巴的抽取，并对抽取到的血淋巴吸附在经多聚赖氨酸处理的防脱玻片上，经固定、渗透、抗体孵育、制片和观察，从而检测稻飞虱血淋巴内的病毒。 具体方法包括以下步骤:O昆虫饲毒:抓取100头室内饲养的2龄稻飞風若虫,于水稻病毒侵染的水稻病株上饲喂2天，随后在健康水稻幼苗上饲养，饲养的不同时间点抓取20头稻飞虱用于检测稻飞虱血淋巴内的病毒；2)Poly-L-lysine玻片的制备:将清洗洁净的圆形玻片用碱液浸泡2小时，双蒸水洗涤5次；再用无水乙醇浸泡30 min,烘干；将玻片放入24孔板中，并且每个孔加入poly-L-lysine溶液，室温孵育2小时；用移液枪吸去孔中的液体，并用双蒸水清洗3次；将玻片放置在24孔板孔沿上，使玻片的两面都暴露在空气中，放置24小时后即可用于吸附血淋巴；2)抽取稻飞虱的血淋巴:将活体昆虫装入玻璃试管，放在冰上使昆虫低温麻醉，然后将麻醉后的稻飞虱倒出并粘附在玻璃胶面上，用解剖镊拔去稻飞虱一侧的后足，吸取1_2μ I 0.01 mol/L PBS溶液，在稻飞虱拔除后足的伤口处反复吸打3-5次，抽取出稻飞虱的血淋巴；3)吸附:将获得的稻飞虱血淋巴滴在处理后的Poly-L-lysine玻片上，28?35°C培养箱内放置40?50 min，使血淋巴吸附在玻片上；4)固定:将吸附后的玻片放入装有200μ I固定液的离心管中，静置10-20 min ；5)渗透:固定后的玻片用pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液清洗两次，再滴加200μ I渗透液处理10-30 min ；6)配制抗体标记液:将荧光抗体与抗体稀释液按1:100的体积比混合，制得荧光抗体标记液，并用锡箔纸包裹避光；每个玻片需30?50 μ I抗体标记液；7)抗体孵育:用pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液清洗渗透后的玻片两次，将荧光抗体标记液滴加在清洗后的玻片上，于37°C恒温孵育45-60 min ；8)制片:孵育结束后，再次用PH值为7.2的0.01mol/L PBS溶液清洗玻片两次；向空白洁净的载玻片上加入一滴抗衰减液，将清洗后的玻片反盖在抗衰减液上；9)观察:在荧光显微镜下观察血淋巴内的病毒蛋白，判断病毒是否侵染稻飞虱血淋巴。 步骤2)中Poly-L-lysine玻片的制备是用0.1 mg/ml的poly-L-lysine溶液处理。 步骤3)中血淋巴的吸附是在30°C培养箱内放置45 min完成。 步骤4)所述固定液为含质量分数为4%多聚甲醛的0.01 mol/L PBS缓冲液。 步骤5)所述渗透液是将0.2 ml TritonX-100溶液加入到10 mL 0.01 mol/L PBS缓冲液，充分搅拌混匀制得。 步骤6)中的荧光抗体是将病毒的抗体与荧光素FITC交联制得；所述抗体稀释液为含质量分数为3% BSA的0.01 mol/L PBS缓冲液。 步骤8)中的抗衰减液是将甘油与0.0lmol/L PBS缓冲液按体积比9:1混合后充分搅拌制得。 本专利技术的特点在于:本专利技术的特点在于建立了稻飞虱血淋巴抽取和吸附的技术，通过将抽取到的稻飞虱血淋巴吸附在poly-1-lysine玻片上，然后通过免疫荧光标记技术检测血淋巴中的病毒，使微量的血淋巴也可用于检测病毒的存在。该技术解决了无法通过常规RT-PCR检测微量血淋巴中病毒的难题，而且使病毒检测的结果直观准确，极大地推动了水稻病毒在介体昆虫血淋巴内侵染的研究。 【附图说明】 图1为本专利技术实施例中白背飞虱若虫的饲毒和饲养。A:昆虫饲毒；B:昆虫在健康水稻上饲养。 图2为本专利技术实施例中poly-1-lysine玻片的制备器材和试剂。A:24孔板；B:圆形玻片；C: poly-1-lysine 试剂。 图3为本专利技术实施例中白背飞虱血淋巴的抽取过程。A:固定昆虫的玻璃胶；B:粘附昆虫的玻璃胶放在载物台上；C:抽取昆虫血淋巴的细枪头。 图4为本专利技术实施例中白背飞虱血淋巴的抽取过程。A:体视镜下拨除昆虫的后足；B:拨除后足的白背飞虱。 图5为以免疫荧光标记技术标记的南方水稻黑条矮缩病毒PlO蛋白在白背飞虱血淋巴的定位，其中6天血淋巴中的绿色荧光即为标记的SRBSDV-P1蛋白。 【具体实施方式】 实施例11.试剂配制I)碱液的配方:用60% (v/v)的乙醇溶液配置10% (w/v)的NaOH溶解。 2) 0.lmg/ml 的 poly-1-lysine:将购置的 lmg/ml 的 poly-1-lysine 液体用蒸懼水按1:9稀释10倍。 3)0.01mol/L PBS:称取 8 g NaCU0.2 g KC1、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4,溶于800 ml蒸懼水中，用HCl调节pH值至7.2,再加蒸懼水定容至IL即可。 4)固定液:称取4 g多聚甲醛溶于100 ml 0.01 mol/L PBS缓冲液中，50°C _60°C加热搅拌溶解，贮存于4°C。 5)渗透液:吸取 0.2 mL 的 TritonX-100 溶液加入到 10 mL 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种稻飞虱血淋巴内病毒蛋白的免疫荧光标记检测方法，其特征在于：通过对稻飞虱血淋巴的抽取，并对抽取到的血淋巴吸附在经多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上，经固定、渗透、抗体孵育、制片和观察，从而检测稻飞虱血淋巴内的病毒。
【技术特征摘要】
1.一种稻飞虱血淋巴内病毒蛋白的免疫荧光标记检测方法，其特征在于:通过对稻飞虱血淋巴的抽取，并对抽取到的血淋巴吸附在经多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上，经固定、渗透、抗体孵育、制片和观察，从而检测稻飞虱血淋巴内的病毒。2.根据权利要求1所述的稻飞虱血淋巴内病毒蛋白的免疫荧光标记检测方法，其特征在于:方法包括以下步骤: O昆虫饲毒:抓取100头室内饲养的2龄稻飞風若虫,于水稻病毒侵染的水稻病株上饲喂2天，随后在健康水稻幼苗上饲养，饲养的不同时间点抓取20头稻飞虱用于检测稻飞虱血淋巴内的病毒； 2)Poly-L-1ysine玻片的制备:将清洗洁净的圆形玻片用碱液浸泡2小时，双蒸水洗涤5次；再用无水乙醇浸泡30 min,烘干；将玻片放入24孔板中，并向每个孔加入poly-L-lysine溶液，室温孵育2小时；用移液枪吸去孔中的液体，并用双蒸水清洗3次；将玻片放置在24孔板孔沿上，使玻片的两面都暴露在空气中，放置24小时后即可用于吸附血淋巴； 3)抽取稻飞虱的血淋巴:将活体昆虫装入玻璃试管，放在冰上使昆虫低温麻醉，然后将麻醉后的稻飞虱倒出并粘附在玻璃胶面上，用解剖镊拔去稻飞虱一侧的后足，吸取1_2μ I0.01 mol/L PBS溶液，在稻飞虱拔除后足的伤口处反复吸打3-5次，抽取出稻飞虱的血淋巴； 4)吸附:将获得的稻飞虱血淋巴滴在处理后的Poly-L-1ysine玻片上，28~35°C培养箱内放置40~50 min ，使血淋巴吸附在玻片上； 5)固定:将吸附后的玻片放入装有200μ I固定液的离心管中，静置10-20 min ； 6)渗透:固定后的玻片用pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液清洗两次，再滴加200μ I渗透液处理10-30 min ； 7)配制抗体标记液:将荧光抗体与抗体稀释液按1:100的体积比混合，制得荧光抗体标记液，并...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾东升，魏太云，陈红燕，陈倩，吴维，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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