一种用于胶质瘤早期诊断的试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及肿瘤诊断试剂盒，具体涉及一种可用于胶质瘤早期诊断的试剂盒，该试剂盒包括鼠抗人B7-H4生物素标记单抗、链霉素抗生素蛋白-过氧化酶工作液等组分，对采集的脑脊液样本进行检测，通过检测脑脊液中的B7-H4分子，做出相应的诊断，该试剂盒可以定量检测脑脊液中B7-H4蛋白表达量，从而预测胶质瘤的患病风险，筛查高危人群，早期诊断胶质瘤患者，鉴别胶质瘤与其他颅内占位病变。其灵敏度为70.8％，特异度为100％，鉴别低级别与高级别胶质瘤的灵敏度为87.5％，特异度为75.0％。本发明专利技术的方法不与人其他细胞因子有交叉反应，为胶质瘤的准确诊断与防治提供了非常有力的技术基础。

【技术实现步骤摘要】
一种用于胶质瘤早期诊断的试剂盒
本专利技术属于生物
，涉及肿瘤诊断试剂盒，具体涉及一种新型的可用于胶质瘤早期诊断的试剂盒，该试剂盒通过检测脑脊液中的B7-H4分子，不仅可以对高危人群进行筛查，而且能够指导肿瘤分期，为寻找灵敏、特异的胶质瘤脑脊液标志物提供了基础。
技术介绍
研究显示，在原发性颅内肿瘤中，脑胶质瘤发病率最高，接近40.5％。胶质瘤占儿童肿瘤的20％，也是实体瘤患儿死亡的首要病因。据调查，胶质瘤发病高峰在30-40岁，具有生存期短、复发率及死亡率高等特点。尤其是胶质母细胞瘤，其2年生存率为27.2％，5年生存率仅为9.8％，尽管近年来的综合治疗(包括手术、放疗、化疗)取得了很大进步，但最新的研究显示其中位生存期仍不到20个月。因此，如何能够对胶质瘤高危人群进行筛查及早期诊断，以便及时开始治疗、延长患者生存期，成为越来越多的科学家和医生关注的课题。胶质瘤临床表现主要包括颅内压增高及神经功能缺失等症状体征，特异性不高，因此，当前胶质瘤的术前诊断主要依靠影像学技术，以MRI平扫加增强为主，CT为辅，此外，PET、SPECT和MRI特殊功能检查如MRS、PWI、DWI、DTI等也可用于鉴别诊断、术前评估、复发检测，但这些影像学诊断依据仍处于经验性标准的阶段，尚不能满足对脑胶质瘤进行高危人群筛查、早期诊断、与其他颅内占位病变鉴别的需求。B7-H4作为B7家族中的新型负性共刺激分子，其在肿瘤免疫中的作用近年来备受瞩目。研究表明T淋巴细胞的充分活化是脑肿瘤免疫的关键。T细胞的活化至少需要两个信号：第一信号由T细胞表面的抗原特异性受体和抗原呈递细胞(APC)或肿瘤细胞表面的MHC抗原肽复合物结合所提供；第二信号则由APC上的共刺激分子(costimulatorymolecules)与T细胞表面的相应受体结合产生，该信号能影响T细胞的活化、增殖及细胞因子分泌。共刺激分子可分为正性和负性，保持正负共刺激信号内在平衡对于维持机体免疫系统功能正常、避免T细胞不必要的激活或抑制意义重大，而肿瘤细胞往往通过低表达正性共刺激分子或高表达负性共刺激分子来逃过机体的免疫监视。B7家族包含了许多重要的协同刺激分子，如B7-1、B7-2、B7-H1等，可促进或抑制T细胞增殖和细胞因子产生，对B细胞活化、抗体产生也发挥重要调节作用。DMKuang等发现在肝癌基质中B7-H1阳性巨噬细胞能抑制肿瘤特异性T细胞免疫，并且该群巨噬细胞在肝癌中的聚集密度与肝癌病人的预后呈负相关。对于新近发现的B7-H4，已有研究确认了脑肿瘤干细胞(braintumorstemcells)可以通过B7-H1/B7-H4途径发生免疫逃逸。随着对B7-H4研究的深入，有部分学者开始着眼于B7-H4与肿瘤预后的关系。Arigami等发现肿瘤组织中B7-H4的含量与胃癌病人的分期、5年生存率显著相关，并可以作为胃癌预后的独立影响因素，此外，他们还研究了外周血淋巴细胞B7-H4表达量的生存分析，并得到了类似的结果。Chen等进行了食管鳞状上皮细胞癌的免疫组化，经分析也证实了B7-H4高表达的肿瘤病人呈现更差的预后。肾癌、黑色素瘤领域也相继证明了B7-H4在肿瘤预后方面的重要性。其中，最引人瞩目的是Irish等的研究，他们发现卵巢癌中B7-H4的表达独立于CA125，若将血清B7-H4单独用于诊断，特异度为97％时灵敏度可达45％，而如果将B7-H4与CA125联合，灵敏度可提高至65％优于传统的CA125诊断方法。这些都提示B7-H4将可作为一种新型肿瘤标志物。ELISA(酶联免疫吸附测定)技术是将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。其基本原理是首先制备酶标抗原或抗体，即使抗原或抗体与某种酶连接，既保留其免疫活性，又保留酶的活性，然后把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，洗涤纯化固相载体上形成的抗原抗体复合物，使得结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例，最后加入酶反应的底物，底物被酶催化变成的有色产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。因此，鉴于ELISA法具有操作简单、敏感度高、可定量的优点，本专利技术的申请人拟通过用ELISA检测脑脊液B7-H4含量，建立一种能对胶质瘤患者进行早期筛查、诊断、鉴别诊断的方法，这对胶质瘤的预防、治疗均有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供新的胶质瘤肿瘤标志物B7-H4，本专利技术通过研究负性共刺激分子B7-H4在胶质瘤病人脑脊液中的表达情况，提出了B7-H4可作为胶质瘤肿瘤标志物；本专利技术的另一目的是提供一种用于胶质瘤早期诊断的试剂盒，本专利技术中，将B7-H4胶质瘤肿瘤标志物用于胶质瘤诊断、筛查和评估预后，能解决当前胶质瘤早期诊断困难、鉴别诊断过于依赖病理的问题并应用于相关治疗方案和预后评估。本专利技术研究显示，人脑肿瘤干细胞能表达B7-H4，对鼠GL261胶质瘤细胞株的相关实验揭示CD133阳性胶质瘤干细胞较CD133阴性的肿瘤细胞表达更高的B7-H4，在体外明显抑制T细胞的免疫功能，在体内促进裸鼠皮下移植瘤的生长，研究还显示，CD11b阳性的小胶质细胞/巨噬细胞也表达B7-H4。进一步，本专利技术进行了B7-H4的临床研究，通过westernblot发现高级别胶质瘤相比低级别胶质瘤表达更多的B7-H4蛋白质，随后的qRT-PCR也从mRNA水平上证实了上述结果。更进一步，为了更直观地展示B7-H4在肿瘤组织中的表达情况，本专利技术中，对正常脑组织以及不同级别的胶质瘤标本实施了免疫组化和免疫荧光染色，验证了B7-H4随着肿瘤级别增高表达增多而在正常组织中几乎不表达的现象，更重要的是，在根据B7-H4染色情况对64例胶质母细胞瘤(WHOIV级)患者进行生存分析后，结果显示，肿瘤组织高表达B7-H4的病人具有相对不良的预后，提示B7-H4或许能够用于指导胶质瘤病人的预后。鉴于小胶质细胞/巨噬细胞是脑组织里的主要免疫细胞，本专利技术中，分选纯化了脑组织以及外周血中的这类细胞，经过流式细胞术分析表明，高级别胶质瘤组织中的B7-H4阳性小胶质细胞/巨噬细胞显著升高。本专利技术通过检测正常人、不同级别胶质瘤患者脑脊液中B7-H4的含量，利用统计学分析揭示B7-H4与胶质瘤的相关性，为胶质瘤的临床体液学诊断提出了B7-H4可作为胶质瘤肿瘤标志物。本专利技术公开了一种胶质瘤诊断试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒可以准确、快速地检测脑脊液中的B7-H4，进而能够对各期胶质瘤做出及时的辅助诊断，具有较高的临床应用价值。本专利技术中，用于胶质瘤早期诊断及鉴别诊断的试剂盒，包括鼠抗人B7-H4单抗、辣根过氧化物酶标记二抗、通用试剂Tween-20、显色底物ABTS、酶标板等。该试剂盒可以定量检测脑脊液中B7-H4蛋白表达量，从而预测胶质瘤的患病风险，筛查高危人群，早期诊断胶质瘤患者，鉴别胶质瘤与其他颅内占位病变。其灵敏度高，可以检测30pg/ml的B7-H4，特异性高，不与人其他细胞因子有交叉反应，为胶质瘤的准确诊断与防治提供了非常有力的技术基础。基于所述的B7-H4在脑脊液中的含量与胶质瘤患者的肿瘤级别存在一定相关性本文档来自技高网...

【技术保护点】
脑脊液B7‑H4蛋白在制备胶质瘤诊断制剂中的用途；所述的B7‑H4蛋白作为胶质瘤肿瘤标志物。

【技术特征摘要】
1.脑脊液B7-H4蛋白在制备胶质瘤鉴别诊断制剂中的用途；所述的B7-H4蛋白作为胶质瘤肿瘤标志物；其中，脑脊液B7-H4蛋白浓度≥133.6170ng/ml时，初步诊断为胶质瘤；脑脊液B7-H4蛋白浓度≥135.1305ng/ml时，初步诊断为高级别胶质瘤。...

【专利技术属性】
技术研发人员：周良辅，毛颖，姚瑜，岳琪，叶红星，阿普拉吉塔，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31