本发明专利技术公开了桑树二氢黄酮醇还原酶启动子及其重组表达载体和应用，桑树二氢黄酮醇还原酶启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，长度为1812bp，包括二氢黄酮醇还原酶基因起始密码子ATG开始的12bp编码序列和上游的1800bp序列，该启动子能够介导外源蛋白在根部特异表达，为植物基因工程的研究和应用提供了具有重要价值的启动子。
【技术实现步骤摘要】
桑树二氢黄酮醇还原酶启动子及其重组表达载体和应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及桑树二氢黄酮醇还原酶启动子，还涉及含有 桑树二氢黄酮醇还原酶启动子的重组表达载体和应用。
技术介绍
桑树是一种多年生木本植物，长期以来，桑树作为家蚕的主要食物来源，对蚕丝 产业的发展起到至关重要的作用。桑树含有丰富的类黄酮化合物，二氢黄酮醇还原酶 (dihydroflavonol4_reductase，DFR)基因是植物类黄酮生物合成途径中的一个关键基因， 该基因的编码产物能够催化二氢黄酮醇的还原反应而生成无色花青素，属于还原型辅酶II 依赖性的还原酶家族。目前该基因已在多种植物中被克隆，序列分析表明其在功能区域的 序列高度保守，并且该基因结构保守，一般由6个外显子和5个内含子组成。桑树DFR基因 (MnDFR)的⑶S序列长度为1008bp，编码336个氨基酸残基，由6个外显子组成。序列分析 表明MnDFR的N端具有预测的NADP结合结构域，其决定底物特异性的关键氨基酸残基为天 冬氨酸，表明MnDFR属于天冬氨酸类型DFR，该类型DFR不能有效的催化二氢山萘酚还原生 成天竺葵素类花青素。MnDFR的表达模式及调控活性由MnDFR启动子序列决定，而现有技术 中尚未见关于MnDFR启动子的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供桑树二氢黄酮醇还原酶启动子，本专利技术的 目的之二在于提供含有桑树二氢黄酮醇还原酶启动子的重组表达载体；本专利技术的目的之三 在于提供桑树二氢黄酮醇还原酶启动子的应用。 为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案： 1、桑树二氢黄酮醇还原酶启动子，核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示。 2、含有所述桑树二氢黄酮醇还原酶启动子的重组表达载体。 优选的，所述重组表达载体由SEQ ID N0. 3所示序列替换pCAMBIA1303载体上35S 启动子而得。 3、所述桑树二氢黄酮醇还原酶启动子在植物根部特异表达外源蛋白中的应用。 优选的，所述植物为拟南芥。 优选的，所述外源蛋白可以为生物活性物质或抗性蛋白，更优选的，所述外源蛋白 为β-葡萄糖苷酸酶。 本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次提供了桑树二氢黄酮醇还原酶启动子，该启 动子可特异性地在转基因植物的根部实现外源基因的高效表达；本专利技术还提供了含有桑树 二氢黄酮醇还原酶启动子的重组表达载体，该重组表达载体能够用于制备转基因植物，获 得在根部特异二氢黄酮醇还原酶启动子下游基因的转基因植株，为特异在植物根部表达外 源蛋白提供了有利的工具。 【附图说明】 为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图： 图1为桑树MnDFR启动子的PCR结果（M表示DL2000Plus DNA Marker，泳道1为 桑树MnDFR启动子的PCR扩增，箭头所示为扩增得到的目的条带）。 图2为植物表达载体pCAMBIA1303-MnDFR的重组质粒与酶切验证（M表示 DL2000Plus DNA Marker，泳道 1 表示 pCAMBIA1303 载体，泳道 2、3 表示 pCAMBIA1303-MnDFR 重组质粒，泳道4、5表示pCAMBIA1303-MnDFR的双酶切验证）。 图3为拟南芥的⑶S染色结果（WT表示野生型拟南芥，Dfrp-3、Dfrp-ll和Dfrp-12 表示不同的转基因阳性植株）。 【具体实施方式】 下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例1、桑树MnDFR基因启动子的获得 设计扩增MnDFR启动子的引物，上游引物为5' -cgtctgaacccggtcctaa-3'（SEQ ID NO. 1)，下游引物为：5' -cttcgatcccatattgctgc-3'（SEQ ID N0.2)。然后以川桑基因组 DNA为模板，SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示序列为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为： 10 X Ex-taq buffer2. 5 μ L，25mM MgCl22 μ L，2. 5mM dNTP2 μ L，川桑基因组 DNA30ng，10 μ Μ 上、下游引物各1 μ L，5U/ μ 1 Ex-taq聚合酶0. 2 μ L，灭菌水补足至25 μ L ;PCR扩增条件为 94°C预变性4分钟；94°C变性40秒，55°C退火40秒，72°C延伸2分钟，进行30个循环；最 后72°C延伸10分钟，4°C保存。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，待溴酚蓝跑至2/3时 停止电泳，溴化乙锭（EB)染色后用清水冲洗，置于紫外灯观察，结果如图1所示。然后切下 含有目的条带的胶块，并使用Takara公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit对 产物进行回收，回收产物与PMD19-T simple载体连接，得pMD19-T simple-MnDFR载体。将 PMD19-T simple-MnDFR载体送测序公司测序。测序结果表明，MnDFR启动子序列如SEQ ID NO. 3所示，长度为1812bp，包括MnDFR基因起始密码子ATG开始的12bp编码序列和上游的 1800bp 序列。 实施例2植物表达载体pCAMBIA1303-MnDFR的构建 根据实施例1获得的桑树MnDFR基因启动子序列和pCAMBIA1303载体序列，选择 合适的酶切位点，设计构建植物表达载体的引物，具体为：上游引物：5' -cgggatcccgtctg aacccggtcctaa-3'（SEQ ID Ν0· 4)，下划线表示 BamHI 酶切位点，下游引物：5' -gactagtctt cgatcccatattgctgc-3'（SEQ ID Ν0· 5)，下划线表示Spel酶切位点。然后以实施例1所得 PMD19-T simple-MnDFR载体为模板，SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 5所示序列为引物进行PCR扩 增，PCR 扩增体系为：10 X Ex-taq buffer2. 5 μ L，25mM MgCl22 μ L，2. 5mM dNTP2 μ L，pMD19-T simple-MnDFR质粒 50pg，10 μ M上、下游引物各 1 μ L，5U/ μ L Ex-taq聚合酶 0· 2 μ L，灭菌水 补足至25 μ L ;PCR扩增条件为94°C预变性4分钟，94°C变性40秒，55°C退火40秒，72°C延 伸2分钟，共30个循环，最后72 °C延伸10分钟，4°C保存。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶 电泳，待溴酚蓝跑至2/3时停止电泳，溴化乙锭（EB)染色后用清水冲洗，置于紫外灯下切下 含有目的条带的胶块，使用Takara公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit对产 物进行回收。 将回收的PCR产物经BamHI和Spel双酶切，回收酶切本文档来自技高网...
【技术保护点】
桑树二氢黄酮醇还原酶启动子，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1. 桑树二氢黄酮醇还原酶启动子，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。2. 含有权利要求1所述桑树二氢黄酮醇还原酶启动子的重组表达载体。3. 根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体由SEQ ID NO. 3所示序列替换pCA...
【专利技术属性】
技术研发人员：何宁佳，亓希武，向仲怀，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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