一种基于SRAP分子标记鉴定柿属种的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于SRAP分子标记鉴定柿属种的方法，所用来鉴定柿属种(变种)的引物是通过在357对引物中经过大量筛选验证得到的引物组合，所述引物组合包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列具体如下：上游引物：TGA GTC CAA ACC GGACA；下游引物：GAC TGC GTA CGA ATT CAA。本发明专利技术提供的快速区分柿属种所用的SRAP引物是经过严格、大量筛选获得，具有较高的稳定性和重复性，仅通过1对引物，1次PCR就可轻松将柿属5个种(变种)区分开来，操作方便，快速准确；本发明专利技术的方法可实现将柿属5个种在任何情况下进行快速、准确的区分，该方法可以结合形态学特征实现柿属野生资源的分类学鉴定。

【技术实现步骤摘要】
-种基于SRAP分子标记鉴定柿属种的方法
本专利技术涉及分子生物学分子标记领域，具体地说涉及一种基于SRAP分子标记鉴 定柿属不同种（变种）的引物组合及其方法。
技术介绍
柿（D. kakiThunb.，2n = 6x = 90)系柿科柿属植物的一种，在我国北纬41。以南 及甘肃的武山、天水和四川的峨眉山、大凉山和云南、特别是黄河流域的山东、河北、河南、 山西、陕西5省广泛的种植。柿起源于我国，在我国已有3000多年的栽培历史。我国柿属 植物除柿种外，还有56个种（变种），其中的野柿是柿种的变种，君迁子可做为柿的砧木，老 鸦柿可作为观赏植物，金枣柿是近年发现的一个新种，此外还有较为常用的浙江柿、油柿、 乌柿等。柿子果味甜蜜，既可生食，又可以加工成柿饼、柿干、柿醋等。柿子的营养价值很高， 享有果中圣品的美誉。 近年来国家柿种质资源圃在我国收集保存了 700多份柿属资源，亟需开展种质资 源的鉴定工作。建立柿属不同种的鉴定技术对于柿属种质资源的有效利用与保护以及柿育 种和产业的可持续发展具有重要的意义。 目前传统的基于形态学品种鉴定方法已经无法满足有效区分或鉴别众多种质 资源的要求，基于DNA分子水平上的植物遗传多样性和物种资源鉴定中的作用已得到公 认，该技术克服了传统形态学、细胞学标记和生化标记易受外界影响的因素。SRAP标记 (Sequence-Related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性）是一种基于PCR的新 型随机引物标记系统。目前SRAP标记已被成功用于遗传多样性分析、遗传图谱构建、QTL定 位分析、品种鉴定和杂种优势等的研究中。许多研究结果表明SRAP标记较RAPD、SSR、ISSR、 AFLP等标记具有更丰富的多态性、且操作简便、重复性高、成本较低、特别是对序列信息未 知的物种省去了开发引物的过程。因此，基于SRAP标记开展柿属种质资源鉴定是可行的。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种基于SRAP标记鉴定区分柿属种的方法，用于快速区分、 鉴定柿属5个种（变种）。 为实现上述目的，本专利技术技术方案如下： -种基于SRAP分子标记鉴定柿属种的方法，所用来鉴定柿属种的引物是通过在 357对引物中经过大量筛选验证得到的引物组合，所述引物组合包括上游引物和下游引物， 其核苷酸序列具体如下： 上游引物：TGA GTC CAA ACC GGACA ; 下游引物：GAC TGC GTA CGA ATT CAA。 具体包括如下步骤： S1 :提取需要进行鉴定、区分的柿属种叶片基因组DNA，稀释到^ngyl/1保存 于-20°C备用； S2 :以S1中提取的DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，回收PCR扩增产物待用； S3 :取S2中的PCR扩增产物用6%的聚丙烯酰胺凝胶进行检测，银染后用凝胶成 像系统软件进行鉴定区分；野柿在342bp和495bp均出现特征性条带，君迁子在1310bp和 1950bp均出现特征性条带；老鸦柿在620bp和710bp均出现特征性条带；金麥柿（D. spp.) 在950bp和1805bp均出现特征性条带 所述步骤S2中SRAP-PCR反应体系为：20 μ 1反应体系，反应体系中含DNA(20ng/ μ 1)3μ 1、Taq DNA 酶（5υ/μ 1)0. 2μ 1、dNTPs(2. 5mmol/L) 1. 4μ 1、弓| 物（ΙΟμπιοΙ/ L) 1. 5 μ 1、Mg2+ (25mmol/L) 2. 0 μ 1、10 X Buffer2. 5 μ 1、ddH207. 9 μ 1 ; SRAP-PCR扩增条件：94°C预变性5min ;前5个循环为94°C变性lmin，35°C退火 lmin，72°C延伸lmin ;后35个循环仅将复性温度变为50°C ;循环结束后，72°C延伸lOmin， 4°C保存。 本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的快速区分柿属种所用的SRAP引物是经过 严格、大量筛选获得，具有较高的稳定性和重复性，仅通过1对引物，1次PCR就可轻松将柿 属5个种区分开来，操作方便，快速准确；本专利技术的方法可实现将柿属5个种在任何情况下 进行快速、准确的区分，该方法可以结合形态学特征实现柿属野生资源的分类学鉴定。 【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本发 明。 实施例1 一种基于SRAP分子标记鉴定柿属种的方法，具体步骤如下： (1)基因组DNA提取： 本专利技术实施例中的柿属种资源都是重要的柿种质资源，这些分属于5个种的份种 质资源均取自国家柿种质资源圃。 每份种质资源均采用改良CTAB法提取DNA，具体步骤为：取0. 2?0. 5g左右经变 色硅胶脱干水分的柿叶于研钵中，加入液氮充分研磨后转入2mL离心管中，加入940uL预热 的（CTAB buffer780uL，PVP140uL，β-巯基乙醇 20uL)提取缓冲液，65°C温浴 30min，交隔 5min混匀一次（轻轻摇匀）。加入940uL氯仿-异戊醇（24 : 1)，轻轻摇匀，4°C，10000rpm， 离心lOmin。取上清转移至一新管，加入等体积（约800uL)氯仿-异戊醇（24 : 1)，轻轻混 勻，4°C，10000rpm，离心lOmin。再取上清至一新管，加入lmL无水乙醇（_20°C提前预冷）， 轻轻混匀后-20°C下静置30min，4°C，lOOOOrpm，lOmin。然后加入300uL70%酒精漂洗沉淀 0嫩，静置511^11(4°〇,41：，10000印111，离心101^11。重复上一步，无需静置，自然干燥0嫩。加 入 200uL TE 溶解 DNA，-20°C保存（或 4°C )。纯化时加入 5 μ L RNA 酶（10g · Γ1)，37°C保 温lh，所得DNA用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测其质量及完整性，纯化产物溶 于 100 μ LddH20, -20°C保存备用。 该步骤中，以幼叶为材料，利用传统CTAB法提取样品DNA。将提取的基因组DNA， 分别用0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA质量和浓度后，稀释工作液浓 度至40ng/μ 1，保存母液和工作液于-20°C冰箱中备用。每个材料名称及所属种见表1。 表1所用柿属种的资源信息本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于SRAP分子标记鉴定柿属种的方法，其特征在于，所用来鉴定柿属种的引物是通过在357对引物中经过大量筛选验证得到的引物组合，所述引物组合包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列具体如下： 上游引物：TGA GTC CAA ACC GGACA； 下游引物：GAC TGC GTA CGA ATT CAA。

【技术特征摘要】
2014.02.28 CN 201410077712.31. 一种基于SRAP分子标记鉴定柿属种的方法，其特征在于，所用来鉴定柿属种的引物 是通过在357对引物中经过大量筛选验证得到的引物组合，所述引物组合包括上游引物和 下游引物，其核苷酸序列具体如下： 上游引物：TGA GTC CAA ACC GGACA ; 下游引物：GAC TGC GTA CGA ATT CAA。2. 如权利要求1所述的基于SRAP分子标记鉴定柿属种的方法，其特征在于：具体包括 如下步骤： 51 :提取需要进行鉴定、区分的柿属种叶片基因组DNA，稀释到40ng μ Γ1保存于-20°C 备用； 52 :以S1中提取的DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，回收PCR扩增产物待用； 53 :取S2中的PCR扩增产物用6 %的聚丙烯酰胺凝胶进行检测，银染后用凝胶成像 系统软件进行鉴定区分；野柿在342bp和49...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨勇，井赵斌，阮小凤，夏乐晗，杨婷婷，张永芳，王仁梓，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61