本发明专利技术公开了一种鉴别浓度对蛋白质分子二级结构影响的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)借助Langmuir-Blodgett成膜技术，将待测蛋白质分子溶液滴加于亚相的表面，观察其能否形成Langmuir单分子膜；(2)若能够生成Langmuir单分子膜，自滴加时刻起，采集表面压力π随时间的变化曲线，即实时π-t动力学曲线；若π-t动力学曲线中的π表现为一上升的，并且最终呈一稳定数值的曲线，则该蛋白质的二级结构保持良好；若π-t动力学曲线中的π表现为一下降趋势，则表明蛋白质被溶剂化严重，二级结构被破坏。本发明专利技术可用于监测蛋白质分子构象的变化，操作简单。通过实时测定不同浓度下蛋白质分子的结构变化来调控设计新型免疫药物。同时，对于指导生产不同分子构象的乳制品具有重要商用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，具体地说是一 种通过采集蛋白质溶液在亚相表面形成Langmuir单分子膜过程的表面压力随时间（π -t) 动力学曲线以及通过压缩Langmuir膜，获得表面压对单分子膜面积的（π-A)吸附等温线 的方法，用以鉴别蛋白质分子构象变化。
技术介绍
作为生命物质的基础，蛋白质具极其重要的地位。蛋白质不同的空间结构也决定 了其功能的千差万别。了解蛋白质构象有利于利用他们的生物活性作用发展免疫科学和 指导乳制品的生产制造。蛋白质的研究中，牛血清白蛋白（BSA)、人血清白蛋白（HSA)最为 常见，在过去十几年里被广泛研究。其中，J. F. Foster在研究牛血清白蛋白水溶液因 PH不 同而引起的构象变化时，提出了一个经典模型：N(normal) - F(fast) - E(expanded)。因 为在蛋白质构象变化过程中，包括空间位阻，范德华力，氢键，疏水效应，以及多肽和周围溶 剂相互作用等多种作用力的相互作用。所以，对于通过捕捉蛋白质构象变化过程中瞬息即 变的外貌变化来澄清蛋白质构象变化的机理是十分困难的。虽然许多实验和理论的工作 都在加深我们对蛋白质构象转变的认识，但是蛋白质构象变化问题仍然没有得到很好的解 决。(1:Foster J. F.，Samsa E. G.，Journal of the American Chemical Societyl951, 73, 3 187-3190. 2:Masaru S.，Joseph F.，Biochemistry 1986, 7, 2172-2182. 3:Khan Μ. Y.，Bioch emicall986, 236, 307-310. 4:Fersht A. R.，Daggett V.，Cell2002, 108, 573-582.5:Pereir a L· G. C.，Theodoly 0·，Blanch H. W.，Radke C. J.，Langmuir2003，19, 2349-2356. 6:Barbos a L. R. S. et al. Biophysical Journal2010, 98, 147-157. 7 :Bramanti E. , Ferrari C. , Angeli V.，Onor M.，Synovec R. E.，Talanta2011，85, 2553-2561.) 目前，在探究引起蛋白质构象变化的因素方面，主要有pH，离子强度，表面活性剂 或脂肪类物质等方面因素。但是，对于蛋白质最常用的溶剂-水，是否会对蛋白质构象的转 变产生影响则很少被研究。直到现在，蛋白质分子浓度变化是否会引起自身构象的变化这 一课题鲜有研究。众所周知，不同结构构象的蛋白质在生物体中承担不同的角色，澄清其 构象的变化对于研究其生物催化活性具有重要意义，已经有相关文献发表，但通过表面化 学的方法，对于设计新型免疫药物、具有高活性的生物催化剂、高质量乳制品及相关的生产 加工具有重要的现实意义。（l:Shen Y.R.，0stroverkhov，Chemical Reviews2006, 106, 114 0-1154. 2:McClellan S. J. , Franses E. , Colloids and Surfaces B:Biointerfaces2003, 28 ,63-75. 3:Noskov B. A. , et al. , Langmuir2010, 26, 17225 - 17231. 3:Bhattacharya M. , Jain N. , Bhasne K. , Kumari V. , Mukhopadhyay S. , Journal of Fluorescence2011, 21, 1083-109 O. 4:Noskov B. A. , Mikhailovskaya A. A. , Lin S. Y. , Loglio G. , Miller R. , Langmuir2010, 26, 17225-1723. 5:Wang J.，Buck S.M.，Chen Z.，Analyst2003, 128, 773-778. 6:Lu J. R.，Su T. J. , Thomas R. K. , Journal of Colloid and Interface Science 1999, 213, 426-437.)
技术实现思路
本专利技术是在提供一种蛋白质构象变化的检测方法。即借助Langmuir-Blodgett成 膜技术，通过实时测定表面压（η)随时间（t)的动力学曲线（π-t)，快速得出蛋白质的构 象变化情况。 本专利技术解决技术问题采用如下技术方案： (1)将待测蛋白质分子溶液借助Langmuir-Blodgett成膜技术制备血清白蛋白的 Langmuir单分子膜； (2)采集蛋白质分子形成Langmuir单分子膜过程的动力学数据；即实时测定 Langmuir单分子膜表面压随时间的π-t动力学曲线；若π-t表现为一上升的、并且最终 呈一稳定数值的曲线，则该蛋白质的二级结构保持良好；若n-t动力学表现为一下降趋 势，这表明蛋白质被溶剂化严重，二级结构被破坏；分子中氢键断裂，取而代之的是与水分 子形成分子间氢键，此时，蛋白质分子从原来的心形结构变成展开状，并伴随催化析氢活性 的降低。 本专利技术所述蛋白质分子的Langmuir单分子膜的制备中以去离子水或磷酸盐缓冲 液为亚相。 与已有技术相比，本专利技术有益效果体现在： (1)本专利技术发现，在外界因素（如温度、压力、pH值、离子强度、表面活性剂的加入 等）恒定条件下，蛋白质溶液还会因自身浓度的不同而发生构象的转变；因此本专利技术采用 LB成膜技术，通过采集蛋白质形成Langmuir单分子膜过程的Langmuir单分子膜表面压随 时间的n _t动力学参数来鉴别蛋白质分子构象变化。 (2)本专利技术可用于监测蛋白质分子构象的变化，操作简单。通过实时测定不同浓度 下蛋白质分子的结构变化来调控设计新型免疫药物。同时，对于指导生产不同分子构象的 乳制品具有重要商用价值。 【附图说明】 图1是构建蛋白质Langmuir膜的示意图 图2是本专利技术水为亚相的π -t动力学曲线 图3是本专利技术水为亚相的π -A等温线 图4是本专利技术PH = 4. 2的磷酸盐缓冲溶液π -t动力学曲线 图5是本专利技术PH = 7. 2的磷酸盐缓冲溶液π -t动力学曲线 图6是本专利技术的圆二色谱图（⑶） 图7本专利技术的消弱全反射谱（FTIR) 图8本专利技术的原子力显微镜图（AFM) 图9本专利技术的原子力显微镜图（AFM) 图10本专利技术的电化学催化析氢 【具体实施方式】 本专利技术可用于鉴别浓度对蛋白质（牛血清白蛋白，人血清白蛋白，酪蛋白，乳白蛋 白，乳球蛋白）分子二级结构的影响，以下实例以牛血清白蛋白为实例进行说明。 实施例1 : 配置浓度为8. Oppm，体积为0. lmL的牛血清白蛋白溶液，将其滴加进盛有190mL 去离子水的亚相中，测量表面压与时间的n _t动力学曲线，找出稳定成膜时间，由图2可 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴别浓度对蛋白质分子二级结构影响的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)借助Langmuir‑Blodgett成膜技术，将待测蛋白质分子溶液滴加于亚相的表面，观察其能否形成Langmuir单分子膜；(2)若能够生成Langmuir单分子膜，自滴加时刻起，采集表面压力π随时间的变化曲线，即实时π‑t动力学曲线；若π‑t动力学曲线中的π表现为一上升的，并且最终呈一稳定数值的曲线，则该蛋白质的二级结构保持良好；若π‑t动力学曲线中的π表现为一下降趋势，则表明蛋白质被溶剂化严重，二级结构被破坏。
【技术特征摘要】
1. 一种鉴别浓度对蛋白质分子二级结构影响的检测方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 借助Langmuir-Blodgett成膜技术，将待测蛋白质分子溶液滴加于亚相的表面，观 察其能否形成Langmuir单分子膜； (2) 若能够生成Langmuir单分子膜，自滴加时刻起，采集表面压力π随时间的变化曲 线，即实时π -t动力学曲线； 若π-...
【专利技术属性】
技术研发人员：苗世顶，何淑莲，黄梅，叶伟，丁丽平，陈德超，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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