肾上腺髓质素测定与用于确定成熟肾上腺髓质素的方法技术

本发明专利技术的主题为用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中利用包含两种结合部分的测定来确定所述败血症患者的体液样品中成熟ADM1-52和/或成熟ADM1-52-Gly的浓度，所述两种结合部分结合成熟ADM1-52和/或成熟ADM1-52-Gly，即氨基酸21-52-氨基SEQ ID No.1或氨基酸21-52-Gly SEQ ID No.2，中两个不同的区域，其中每一个所述区域包含至少4个或5个氨基酸。本发明专利技术的主题还为测定与校准方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肾上腺髓质素测定与用于确定成熟肾上腺髓质素的方法本专利技术的主题为用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中利用包含两种结合部分的测定确定所述败血症患者的体液样品中成熟ADM1-52和/或成熟ADM1-52-Gly的浓度，所述两种结合部分结合成熟ADM1-52和/或成熟ADM1-52-Gly区域，即氨基酸21-52-氨基SEQIDNo.1或氨基酸21-52-GlySEQIDNo.2，中两个不同的区域，其中每一个所述区域包含至少4个或5个氨基酸。本专利技术的主题还为测定与校准方法。在Kitamura等(参阅1；数值基于参考文献附表)中首次描述了肾上腺髓质素(ADM)肽，其为包含52个氨基酸的新的降低血压的肽，该肽已自人嗜铬细胞瘤中分离出来。同一年，也描述了编码包含185个氨基酸的前体肽的cDNA和这一前体肽的完整的氨基酸序列。前体肽，特别是包含在N末端处的21个氨基酸的信号序列，被称为“肾上腺髓质素前体原”(pre-proADM)。pre-proADM包含185个氨基酸并且具有SEQIDNo:3的序列。成熟ADM显示于SEQIDNo.4中而成熟ADM-Gly显示于SEQIDNo.5中。肽肾上腺髓质素(ADM)为包含52个氨基酸(SEQIDNo:2)的肽，并且包含pre-proADM的95-146氨基酸肽，肾上腺髓质素通过蛋白水解裂解自pre-proADM形成。迄今为止，基本上只有很少的pre-proADM裂解中所形成的肽片段的片段被更准确地表征，尤其是，生理活性肽肾上腺髓质素(ADM)和“PAMP”，包含在pre-proADM中信号肽的21氨基酸之后的20个氨基酸(22-41)的肽。对ADM和PAMP而言，还已发现并且更为详尽地研究了其生理活性亚片段。1993年ADM的发现与表征引发了强烈的研究活动和潮水般的出版物，最近以各种综述概括了这些结果，在本说明书的上下文中，参考文献尤其是出自期刊“肽(Peptides)”的文章致力于ADM(Peptides22(2001))，特别是(2)和(3)。另一综述为(4)。在目前的科学研究界，尤其ADM可被认为是多功能的调节肽。它以通过甘氨酸所延伸的非活性的形式被释放到血液循环中(5)。也存在特异性针对ADM的结合蛋白(6)并且可能也调节ADM的作用。目前研究中最重要的ADM及PAMP的那些生理效应为影响血压的效应。因此，ADM为有效的血管舒张剂，可能它降低血压的效应与ADMC末端部分中的特别的肽片段有关。还已发现上述的自pre-proADM形成的另一生理活性肽PAMP同样地显示出降低血压的效应，尽管看起来它具有不同于ADM的作用机制(参阅上述的综述(3)和(4)，以及(7)、(8)或(9)和(10))。还已发现在许多病理状态下可以在血液循环和其他体液中测量到的ADM的浓度显著地高于在健康对照人群中发现的浓度。因此，患有充血性心力衰竭、心肌梗塞、肾脏疾病、高血压病症、糖尿病、休克急性期和败血症及败血性休克的患者中ADM水平显著地增加，尽管程度不同。在一些所述的病理状态中PAMP浓度也增加，但是血浆水平相对于ADM下降((3)；1702页)。还已知将在败血症或败血性休克中观察到异常高的ADM浓度(参阅(3)和(11)、(12)、(13)、(14)和(15))。这发现与典型的血液动力学改变有关，所述典型的血液动力学改变被称为患有败血症和其他严重的综合征，诸如例如SIRS患者病程的典型现象。尽管推测ADM和PAMP形成于同一前体肽，pre-proADM(SEQIDNo:3)，其中对应这些肽的氨基酸序列以等摩尔量的局部肽存在，生物体液中可测的ADM与PAMP浓度明显地不同。这是没有什么异常的。因此，同一前体肽的不同的裂解产物的可测浓度可能是不同的，例如，因为它们是不同的竞争性裂解途径的结果，例如在不同的病理状态下，不同的竞争性裂解途径导致不同的前体肽碎裂并因此导致不同的裂解产物。前体肽中所含的某些局部肽可形成为游离肽，或可以不形成，和/或不同的肽以不同的方式和不同的量形成。即使认为只有单一的裂解途径用于处理前体肽，并且因此所有裂解产物都源于同一个前体肽而且必须以等摩尔量形成自身，生物体液中可测的不同局部肽和片段的稳态浓度可能非常不同，即，例如，当单独个体以不同的速率形成和/或在各自的生物体液中具有不同的个体稳定性(寿命)时，或如果基于不同的裂解机制和/或以不同的裂解速率将它们从血液循环中移除。肾上腺髓质素在败血症发展期间((16)、(17))和许多急性的及慢性的疾病((18)、(4))中发挥了关键作用。ADM在败血症和败血症后果预后((19)、(14)、(11))中是升高的。对早期监测治疗成功或失败而言，败血症治疗随访为基本上尚未满足的临床需求。目前没有适用于常规诊断的ADM测定。当前可用的用于测定成熟ADM的测试的敏感性太低。因此，需要高血浆量用于分析。而且，目前可用的测定显示出与预分析局限性有关的稳定性，例如，需要通过抑肽酶稳定样品((20)、(21))。加之，一些ADM测定在测量前需要大量的样品制备(11)。本专利技术的目标为提供适合作为直接测量成熟ADM的常规方法，适用于标准的自动化实验室和即时护理技术。令人惊奇地，结果表明此类测定可用于败血症患者的治疗随访。本专利技术的主题为用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中利用包含两种结合部分的测定确定所述败血症患者的体液样品中成熟ADM1-52和/或成熟ADM1-52-Gly的浓度，所述两种结合部分结合成熟ADM1-52和/或成熟ADM1-52-Gly区域，即氨基酸21-52-氨基SEQIDNo.1或氨基酸21-52-GlySEQIDNo.2，中两个不同的区域，其中每一个所述区域包含至少4个或5个氨基酸。在本专利技术的一实施方案中，主题为用于败血症患者治疗随访的体外方法，其中所述结合部分中的一种结合成熟ADM和/或成熟ADM1-52-Gly下列序列中所包含的区域：ADM21-32:CTVQKLAHQIYQ(SEQIDNo.6)并且其中所述这些结合部分中的另一种结合成熟ADM和/或成熟ADM1-52-Gly下列序列中所包含的区域：ADM42-52:APRSKISPQGY(SEQIDNo.7)在本专利技术的一实施方案中，所述测定的测定敏感性能够定量健康人的ADM，其为<10pg/ml,优选地<40pg/ml并且更优选地<70pg/ml。在本专利技术的一实施方案中，所述结合部分显示出与成熟ADM和/或成熟ADM1-52-Gly结合亲合力至少107M-1,优选108M-1,优选的亲合力大于109M-1,最优选的大于1010M-1。本领域的技术人员已知可以考虑通过应用更高剂量的化合物来弥补较低的亲合力，并且这种测量不会导致超出本专利技术的范围。为测定肾上腺髓质素抗体的亲合力，借助于无标记的表面等离子共振技术利用Biacore2000系统(GEHealthcareEuropeGmbH,弗赖堡,德国)测定肾上腺髓质素结合固体化抗体的动力学。根据制造说明书(小鼠抗体捕获试剂盒，GEHealthcare)，利用高密度共价地接合至CM5感应器表面的抗小鼠Fc抗体进行抗体的可逆固定(22)。在本专利技术的一实施方案中，所述结合部分选自抗肾上腺髓质素本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于疑似患有败血症的患者的治疗随访的体外方法，其中利用包含两种结合部分的测定来确定所述败血症患者的体液样品中成熟ADM1‑52和/或成熟ADM1‑52‑Gly的浓度，所述两种结合部分结合成熟肾上腺髓质素和/或成熟肾上腺髓质素‑Gly区域，即氨基酸21‑52‑氨基(SEQ ID No.1)或氨基酸21‑52‑Gly(SEQ ID No.2)，中两个不同的区域，其中每一个所述区域包含至少4个或5个氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.16 EP 11189452.3;2011.11.16 EP 11189449.9;1.两种结合部分在制备用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly和/或肾上腺髓质素-Gly的试剂中的用途，其中所述两种结合部分选自抗肾上腺髓质素抗体，或结合ADM的抗ADM抗体片段，或结合肾上腺髓质素的非Ig骨架，所述两种结合部分结合SEQIDNo.1所示的氨基酸21-52-氨基或SEQIDNo.2所示的氨基酸21-52-Gly中两个不同的区域，其中每一个所述区域包含至少4个或5个氨基酸，并且其中所述试剂不用于人工包被管吖啶酯夹心测定。2.两种结合部分在制备用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly和/或肾上腺髓质素-Gly的试剂中的用途，其中所述两种结合部分选自抗肾上腺髓质素抗体，或结合ADM的抗ADM抗体片段，或结合肾上腺髓质素的非Ig骨架，所述两种结合部分结合SEQIDNo.1所示的氨基酸21-52-氨基或SEQIDNo.2所示的氨基酸21-52-Gly中两个不同的区域，其中每一个所述区域包含至少4个或5个氨基酸，并且其中所述试剂用于人工包被管吖啶酯夹心测定，且其中所述结合部分中的一种为结合SEQIDNo.6CTVQKLAHQIYQ的抗体，其中所述结合部分中的另一种为结合SEQIDNo.7APRSKISPQGY-CO-NH2的抗体。3.如权利要求1所述的用途，其中所述结合部分中的一种与SEQIDNo.4所示的成熟ADM和/或成熟ADM1-52-Gly的序列中所含的区域结合，并且其中所述这些结合部分中的另一种与成熟ADM和/或SEQIDNo.5所示的成熟ADM1-52-Gly的序列中所含的区域结合。4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述试剂的测定敏感性能够定量健康个体的ADM，为<10pg/ml。5.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述试剂的测定敏感性能够定量健康个体的ADM，为<40pg/ml。6.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述试剂的测定敏感性能够定量健康个体的ADM，为<70pg/ml。7.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述结合部分展示了至少107M-1的与肾上腺髓质素的结合亲合力。8.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述结合部分选自抗肾上腺髓质素抗体，或结合ADM的抗ADM抗体片段，或结合肾上腺髓质素的非Ig骨架。9.如权利要求1或3所述的用途，其中所述试剂用于夹心测定。10.如权利要求9所述的用途，其中所述试剂用于全自动测定。11.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中标记所述两种结合部分中的至少一种以便于检测。12.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述两种结合部分中的至少一种与固相结合。13.如权利要求11所述的用途，其中所述标记选自化学发光标记、酶标记、荧光标记、放射性碘标记。14.用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly和/或肾上腺髓质素-Gly的试剂盒，其包含两种结合部分，所述两种结合部分选自抗肾上腺髓质素抗体，或结合ADM的抗ADM抗体片段，或结合肾上腺髓质素的非Ig骨架，所述两种结合部分结合SEQIDNo.1所示的氨基酸21-52-氨基或SEQIDNo.2所示的氨基酸21-52-Gly中两个不同的区域，其中每一个所述区域包含至少4个或5个氨基酸，并且其中所述试剂盒不用于人工包被管吖啶酯夹心测定，且所述试剂盒的组分可包含在一个或多个容器内。15.如权利要求14所述的试剂盒，其中所述结合部分中的一种与SEQIDNo.4所示的成熟ADM和/或成熟ADM1-52-Gly的序列中所含的区域结合，并且其中所述这些结合部分中的另一种与成熟ADM和/或SEQIDNo.5所示的成熟ADM1-52-Gly的序列中所含的区域结合。16.用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly和/或肾上腺髓质素-Gly的试剂盒，其包含两种结合部分，所述两种结合部分选自抗肾上腺髓质素抗体，或结合ADM的抗ADM抗体片段，或结合肾上腺髓质素的非Ig骨架，所述两种结合部分结合SEQIDNo.1所示的氨基酸21-52-氨基或SEQIDNo.2所示的氨基酸21-52-Gly中两个不同的区域，其中每一个所述区域包含至少4个或5个氨基酸，并且其中所述试剂盒用于人工包被管吖啶酯夹心测定，且其中所述结合部分中的一种为结合SEQIDNo.6CTVQKLAHQIYQ的抗体，其中所述结合部分中的另一种为结合SEQIDNo.7APRSKISPQGY-CO-NH2的抗体。17.如权利要求14-16中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒的测定敏感性能够定量健康个体的ADM，为<10pg/ml。18.如权利要求14-16中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒的测定敏感性能够定量健康个体的AD...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德里亚斯·伯格曼，
申请(专利权)人：斯弗因高泰克有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE