一种猴头菌细胞壁多糖及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种猴头菌细胞壁多糖及其制备方法，该猴头菌细胞壁多糖包含水溶性和碱溶性的细胞壁多糖，是通过胞内多糖的去除、粉碎水提、碱提和醇沉而制备得到的。本发明专利技术的方法充分提取了猴头菌中的细胞壁多糖，所得胞壁多糖的得率及含量都很高，可明显促进RAW264.7巨噬细胞株释放NO，具有体外免疫活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食药用真菌提取领域，具体的说是涉及一种猴头菌细胞壁多糖及其制 备方法
技术介绍
猴头菌（Hericium erinaceus)，在分类学上隶属于菌物界，担子菌门，担子菌纲， 猴菇目，猴菇科，猴菇属，又名猴头蘑、熊头菇、刺猬菌，肉嫩味美，营养丰富，是著名的药食 两用菌，国内已经广泛用于医治消化不良、胃溃疡、食道癌、胃癌、十二指肠癌、贲门癌等消 化系统的疾病。猴头多糖是猴头菌的主要有效成分，研究表明猴头多糖具有抗肿瘤、提高免 疫力、降血糖、抗突变、抗衰老等功效。 目前针对猴头菌多糖的研究和利用主要是针对水提胞内多糖，其相关的制备工艺 已有很多报道，但对于细胞壁多糖的提取还没有系统全面的报道。值得说明的是，常规水提 多糖后的猴头菌子实体残渣量非常可观，含有丰富的细胞壁多糖且它主要是由几丁质和葡 聚糖组成，这部分多糖通常没有继续提取利用而被丢弃。真菌细胞壁多糖通常是β构型的 葡聚糖，而且多以β_1，3、β-1，6方式连接，这部分葡聚糖具有很强的免疫活性。我们研究 也发现猴头菌细胞壁多糖是以β构型的葡聚糖为主要成分，对其开发利用将有利于充分 发挥猴头菌多糖的功效作用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种猴头菌细胞壁多糖的制备方法，该方法包括如下步骤： ①胞内多糖的去除：将猴头菌加入10-20倍重量的水，常温浸泡30_60min，加热至 沸腾，保持60-120min，过滤，收集残渣1 ; ②粉碎水提：将残渣1粉碎，加入10-20倍重量的水，常温浸泡30-60min，沸水提 取，离心，分别收集上清液和残渣2 ; ③碱提：将残渣2,按料液比l:10-l:20(W/v)加入0· 1-1M的NaOH溶液，4-10°C浸 提2-4h，离心，收集提取液； ④醇沉：对步骤②中收集的上清液和步骤③中收集的提取液进行醇沉，离心收集 沉淀，即为猴头菌细胞壁多糖。 其中步骤④中，对步骤②中收集的上清液和步骤③中收集的提取液进行醇沉，可 以分别进行，得到的沉淀再合并；也可以先将上清液和提取液合并后再醇沉，最后收集沉 淀。 其中步骤②中收集的上清液进行醇沉后，得到的沉淀为水溶性猴头菌细胞壁多 糖；对步骤③中收集的提取液进行醇沉后，得到的沉淀为碱溶性猴头菌细胞壁多糖。 本专利技术还提供了一种由上述方法制备得到的猴头菌细胞壁多糖，其包括水溶性细 胞壁多糖和碱溶性细胞壁多糖。 本专利技术采用残渣粉碎水提和水提后再碱提的方法制备猴头菌细胞壁多糖，得到的 细胞壁多糖颜色浅、得率高，达到9. 7%，多糖含量在50%以上。该专利技术能充分提取猴头菌 子实体中的细胞壁多糖，提高了猴头菌子实体原料的利用率，且制备的猴头菌细胞壁多糖 能够显著刺激巨噬细胞释放NO,从而增强机体的抗肿瘤能力。 【具体实施方式】 制备猴头菌水溶性细胞壁多糖： ①胞内多糖的去除：将猴头菌子实体加入10-20倍重量的水，常温浸泡30-60min， 加热至沸腾，保持60-120min，过滤，残渣重复上述步骤，至滤液通过苯酚-硫酸法检测不到 多糖为止，40-60°C烘干残渣； ②粉碎水提：将上述残渣粉碎5-20min (粉碎粒度200-300目），加入10-20倍重 量的水，常温浸泡30-60min，加热至沸腾，保持60-120min，9803g离心15min，残渣重复上述 步骤，再提取1-2次，收集上清液和残渣； ③醇沉：上清液浓缩至料液比（w/v)为1:4-1:6,然后添加入无水乙醇，至乙醇终 浓度达到60 % -80 %，4°C静置8-12h，离心收集沉淀，用70 % -90 %的乙醇洗涤沉淀2-3次； ④干燥：沉淀加水溶解，挥干乙醇后冷冻干燥即获得所需的水溶性胞壁多糖； 制备碱溶性细胞壁多糖： 将上述制备猴头菌水溶性细胞壁多糖步骤②中收集的残渣于40-60°C烘干，按料 液比l:10-l:20(w/v)加入0. 1-1M的NaOH溶液，4-10°C浸提2-4h，高速离心，残渣重复上述 步骤，再提取1-2次，合并提取液； 提取液通过3-6M的HC1调PH7. 0,高速离心，浓缩至料液比（w/v)为1:4-1:6,向 该浓缩液中加入无水乙醇，至乙醇终浓度达到60% -80%，4°C静置8-12h，离心收集沉淀， 用70% -90 %的乙醇洗涤沉淀2-3次； 沉淀加水溶解，挥干乙醇后冷冻干燥即获得所需的碱溶性细胞壁多糖。 合并水溶性细胞壁多糖和碱溶性细胞壁多糖，即得到所需的猴头菌细胞壁多糖。 实施例1 : 水溶性猴头菌细胞壁多糖的提取： 猴头菌子实体购于上海国森生物科技有限公司。 将猴头菌加入15倍重量的水，常温浸泡30min，加热至沸腾，保持120min，过滤，收 集残渣，重复上述步骤至胞内多糖提取完全，收集残渣1 ; 将残渣1粉碎15min (粉碎粒度200-300目），称取200g，加入4L水，室温浸泡 30min，加热至沸腾，保持120min，9803g离心15min，沉淀重复上述步骤，再提取2次，合并提 取液，留取残渣2备用； 提取液高速离心，浓缩至料液比1:5,然后添加入无水乙醇，至乙醇终浓度达到重 量百分比为70 %，4°C静置12h，离心收集沉淀，用80 %的乙醇洗涤沉淀3次； 最后沉淀加水溶解，挥干乙醇后冷冻干燥即获得所需的水溶性猴头菌细胞壁多 糖。 碱溶性猴头菌胞壁多糖的提取： 将残渣2于50°C烘干； 将残渣2和碱液按照料液比1 :20 (w/v)加入0. 5M的NaOH溶液，4°C浸提4h，浸提 1次，9803g离心15min，收集提取液； 提取液用6M的HC1调PH7. 0,再经高速离心，浓缩至料液比1 :5,向该浓缩液中加 入无水乙醇，至乙醇终浓度达到重量百分比为70%，4°C静置12h，离心收集沉淀，用80%的 乙醇洗涤沉淀3次； 沉淀加水溶解，挥干乙醇后冷冻干燥即获得所需的碱溶性猴头菌细胞壁多糖。 合并水溶性猴头菌细胞壁多糖和碱溶性猴头菌细胞壁多糖，即得猴头菌细胞壁多 糖。 多糖得率及含量测定：多糖得率=多糖的质量（g)/子实体的质量（g) X 100% 多糖含量用苯酚-硫酸法测定，精密称取本品10mg置100ml容量瓶中，加水约 80ml，加热助溶后冷却至室温，在100ml容量瓶中定容。精密吸取样品1. 0ml，置15ml试管 中，分别加入苯酚、硫酸试剂，充分反应后在490nm处测定吸光度值，以葡聚糖为标准品计 算样品的糖含量。 制备所得的猴头菌细胞壁多糖得率为9. 7%，多糖含量为58. 4%。 实施例2 : 细胞壁多糖体外刺激巨噬细胞释放NO的活性测定 1、样品准备：称取实施例1中制备得到的猴头菌细胞壁多糖于灭菌的eppendorf 管中，用无菌的PBS配置成浓度5mg/mL的溶液。充分溶解后以15000r/min离心30min，无 菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成2mg/ml、0. 5mg/mL待用。 2、细胞培养：取对数生长期的RAW264. 7巨噬细胞株（购自中科院细胞所），用 DMEM完全培养基（购自Gibco公本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猴头菌细胞壁多糖的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：①胞内多糖的去除：将猴头菌加入10‑20倍重量的水，常温浸泡30‑60min，加热至沸腾，保持60‑120min，过滤，收集残渣1；②粉碎水提：将残渣1粉碎，加入10‑20倍重量的水，常温浸泡30‑60min，沸水提取，离心，分别收集上清液和残渣2；③碱提：将残渣2，按料液比1:10‑1:20(w/v)加入0.1‑1M的NaOH溶液，4‑10℃浸提2‑4h，离心，收集提取液；④醇沉：对步骤②中收集的上清液和步骤③中收集的提取液进行醇沉，离心收集沉淀，即为猴头菌细胞壁多糖。

【技术特征摘要】
1. 一种猴头菌细胞壁多糖的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤： ① 胞内多糖的去除：将猴头菌加入10-20倍重量的水，常温浸泡30-60min，加热至沸 腾，保持60-120min，过滤，收集残渣1 ; ② 粉碎水提：将残渣1粉碎，加入10-20倍重量的水，常温浸泡30-60min，沸水提取，离 心，分别收集...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨焱，唐川，吴迪，刘艳芳，张劲松，颜梦秋，唐传红，唐庆九，周帅，张忠，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31