一种木蹄复方提取物及其制备方法与用途技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域。具体的说，本发明专利技术涉及一种木蹄复方提取物及其制备方法和用途。木蹄复方按重量比组成为：木蹄层孔菌(1～10)∶松针层孔菌(1～9)∶赤芝(1)，复方提取物的提取方法为：配制好的术蹄复方，混合之后粉碎，加纯水，水提醇沉后取上清液，减压浓缩，浓缩液真空干燥，即得。本发明专利技术中木蹄复方提取物中三萜和三萜皂苷的含量不低于5.5％。该提取物具不仅具有有显著的体外和体内抗肿瘤功效，而且没有明显急性毒性，小鼠的最大耐受量为0.2g(折合生药量为4.58g)，为人口服用量的327倍。该提取物与药学上可接受的载体混合，可制成复方制剂，其中复方制剂包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。

【技术实现步骤摘要】
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本专利技术涉及生物医药
。具体的说，本专利技术涉及一种木蹄复方提取物及其 制备方法，该复方提取物主要用于体外和体内抑制肿瘤细胞生长。 2
技术介绍
近年来，我国肿瘤发病率处于快速上升期，每年癌症发病人数约260万，死亡180 万，已成为中国城市和农村居民第一死因。由于肿瘤手术切除、化疗和放疗都存在固有缺 陷，天然药物或中药抗肿瘤研究被日益重视。药用真菌是天然药物中的一个重要组成部分， 而抗肿瘤作用是药用真菌重要的功效之一。 其中，木蹄层孔菌Fomes fomentarius(L. :Fr)Kick.又名桦菌芝，是多孔菌科、层 孔菌属的药用真菌。《中华本草》中记载：木蹄层孔菌子实体无柄。菌盖马蹄形，长径3-40cm， 短径2-27cm，厚2-18cm。表面有厚角质皮壳，灰色、浅褐色或黑色，光滑，有明显的同心环棱 纹。管口面浅褐色或灰色，管口圆形，每1mm间3-4个。纵剖面可见菌管多层，每层厚5-25mm。 木栓质。气微，味淡。其药理作用主要是：显着提高实验小鼠减压缺氧的耐受能力，延长其 存活时间，具有抗疲劳、抗高温的作用。并且能影响缺氧机体肠系膜微循环的流速、流态，对 微循环具有改善作用。主治：消积；化瘀；抗癌（食管癌；胃癌和子宫癌）。通过小鼠实验已 证明：木蹄层孔菌中分离出的单宁类酚性物对小鼠移植性肿瘤S180有明显杀灭作用，而张 丽萍等深入研究发现木蹄层孔菌多糖对S180肿瘤细胞并无直接杀伤作用，而是通过激活 动物机体的免疫功能，激活巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤性T细胞的活性，从而增强对肿 瘤免疫功能。 松针层孔菌Phellinus pini.又名松针灵芝、松木层孔菌，为多孔菌科、层孔菌属 药用真菌。《中国大型真菌原色图鉴》记载：其子实体多年生，木栓质，无辆，菌盖扁米球形 至马蹄形，4-14厘米7X24厘米，罕达23厘米X40厘米，厚2. 5-18. 5厘米或更大。盖面初 期有红褐色胶状皮壳，渐角质化而成灰色至黑色，并有宽的棱带，边缘往钝，初期近白色，后 渐变淡黄色至赤粟色，下侧无子实层。菌肉近白色至淡黄褐色，有环纹，木栓质至木质。厚 0.5-2厘米，味苦。菌管多层，每层厚3-5毫米，淡黄色，管口白色至乳白色。孢子卵圆形或 椭圆形，无色。生于松、云杉、冷杉、铁杉及落叶松等针叶树的树干或朽木上。偶尔也生于阔 叶树的枯腐木上。王稳航、刘安军等对松针层孔菌的药理作用进行了比较系统的研究，结果 显示：松针灵芝的三种多糖均不同程度地提高了小鼠血清、心、肝、脑、脾中SOD、GSH-Px活 力，降低了 MDA生成量，而对T0AC值影响较小；同时，三利多糖均显著提高了小鼠体内血清 N0生成量。同时，他们提出三种多糖的抗氧化机制可能与其它抗氧化剂不同，其对小鼠体内 氧化压力和抗氧水平呈双重增加效果，可能是由于多糖作为免疫物质引起机体的免疫反 应造成的。松针层孔菌是针叶林里红野生松、落叶松、云杉最主要的、危害最大的火立木腐 朽菌，对于针叶林无疑是一种癌，但是对于人类却是抑制肿瘤、治疗癌症的一剂良药。《中国 大型真菌原色图鉴》73页中记载：松针子实体含齿孔酸等活性物质，是所有真菌中治疗癌症 效果最好的品种，子实体提取物对小白鼠肉瘤180及艾氏腹水癌的抑制率均达100 %。然 而，松针具有毒性，为达到中医理论中扶正祛邪的目的，所以松针必须要与其他中药配合才 可解除毒性，安全使用。目前采用松针层孔菌为主要成份治疗各类癌症的有效配方的机构， 国内外仅有两家，一家是美国的CELG，另一家用国内的汉草荟。 赤芝Ganoderma lucidum(Leyss. ex Fr)Karst为多孔菌科、灵芝属药用真菌。据 《中国药典》记载：赤芝外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，直径10?18cm，厚1? 2cm。皮壳坚硬，黄褐色至红褐色，有光泽，具环状棱纹和辐射状皱纹，边缘薄而平截，常稍内 卷。菌肉白色至淡棕色。菌柄圆柱形，侧生，少偏生，长7?15cm，直径1?3. 5cm，红褐色 至紫褐色，光亮。孢子细小，黄褐色。气微香，味苦涩。其主要功效为：补气安神，止咳平喘。 用于眩晕不眠，心悸气短，虚劳咳喘。此外，赤芝抗肿瘤功效已被广泛报道，其抗肿瘤机制也 已被深入研究，主要包括：1.促凋亡：通过促进Bax表达，同时抑制Bcl-2和Bcl-xl等基因 表达，从而抑制淋巴瘤、炎性乳腺癌等生长，促使其凋亡；2.生长抑制：通过抑制周期蛋白 cyclinDl，抑制卵巢癌细胞生长；3.提高免疫：灵芝多糖和三萜类物质能广泛调节免疫细 胞和免疫相关细胞的功能，包括B细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞等，同时它们 还时以促进TNF-α表达，降低IL-10, TGF-β 1和VEGF表达，增强免疫应答强度。 目前，中药、天然药物复方已经成为治病用药的最主要形式之一，把不同药理机制 的真菌组成复方更有利于抗肿瘤治疗。本研究首次提出木蹄层孔菌、松针层孔菌和赤芝三 者结合，以达到扶正气，提高肿瘤免疫、肿瘤杀伤的作用。 3
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种高效低毒的木蹄复方提取物及制备方法。 本专利技术的另一目的在于提供该提取物在体内和体外抗肿瘤中的用途。该提取物能 在体外显著杀伤肿瘤细胞，并有效抑制小鼠体内肿瘤生长；并且小鼠口服和腹腔注射均没 有发现明显毒性，最大耐受剂量为l〇g/kg。 本专利技术涉及一利有显著抗肿瘤功效的、低毒性的木蹄复方提取物及制备方法。 本专利技术木蹄复方中，木蹄层孔菌：松针层孔菌：赤芝的重量比为1?10 : 1? 9:1。 优选地，本专利技术木蹄复方中，木蹄层孔菌：松针层孔菌：赤芝的重量比为2? 7 : 1 ?6 : 1。 更优选地，本专利技术木蹄复方中，木蹄层孔菌：松针层孔菌：赤芝的重量比为4? 5 : 1 ?3 : 1。 本专利技术制备木蹄复方提取物方法步骤如下： 步骤一：木蹄层孔菌、松针层孔菌和赤芝按照重量比要求配成木蹄复方，混合之后 粉碎； 步骤二：粉碎之后的木蹄复方加纯水，l〇〇°C加热回流提取3次，每次2小时，料液 比分别为1 : 20、1 : 15和1 : 10,4°C静置24小时后，gOOOr.mirT1离心30分钟，上清液 减压浓缩20倍体积。之后，浓缩液再加95%乙醇，使乙醇终浓度为80%，在4°C静置24小 时后，9000r · mirT1离心30分钟，取上清液，减压浓缩20倍体积，浓缩液真空干燥，即得。 本专利技术制备的木蹄复方提取物，其成分分析结果显示其含有机酸，氨基酸、多肽和 蛋白质，糖、多糖和苷类，皂苷，内酯、香豆素及其苷类，植物留醇和三萜成分以及挥发油和 油脂等多种成分，其中三萜类和三萜皂苷的含量不低于5. 5%。 本专利技术制备的木蹄复方提取物，其用途在于：⑴该提取物在体外对人肺腺癌 细胞（A549)、人宫颈癌细胞（Hela)、人肝癌细胞（QGY)、人前列腺癌细胞（DU145)、人结 肠癌细胞（HCT116)、人食管癌细胞（Ecal09)、人乳腺癌细胞（MDA-MB-435S)、人胃癌细胞 (SGC-7901)、人成骨肉瘤细胞（Saos-2)、人骨肉瘤细胞（U20s)等肿瘤细胞株有显著杀伤作 用。（2)该提取物能有效诱导细胞凋亡，终浓度为100 μ g/ml作用24h后，A549的凋亡率为 本文档来自技高网...

【技术保护点】
木蹄复方提取物，其特征在于三萜类和三萜皂苷的含量不低于5.5％。

【技术特征摘要】
1. 木蹄复方提取物，其特征在于三萜类和三萜皂苷的含量不低于5. 5%。2. 权利要求1所述木蹄复方提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤， 步骤一：将木蹄复方粉碎； 步骤二：粉碎之后的木蹄复方加水，加热回流提取，低温静置后，离心，上清液减压浓 缩。之后，浓缩液再加乙醇，使乙醇终浓度为80%，在低温静置后，离心，取上清液，再次减压 浓缩，浓缩液真空干燥，即得。3. 权利要求1中所述木蹄复方提取物的用途，其特征为：（(1)该提取物在体外对人肺 腺癌细胞（A549)、人宫颈癌细胞（Hela)、人肝癌细胞（QGY)、人前列腺癌细胞（DU145)、人 结肠癌细胞（HCT116)、人食管癌细胞（Ecal09)、人乳腺癌细胞（MDA-MB-435S)...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘琼，沈先荣，何颖，蒋定文，刘玉明，侯登勇，陈伟，王庆蓉，钱甜甜，莫琳芳，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军医学研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31