一种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体及其制备方法，包括相偶联的针对病毒核心蛋白的抗体和蛋白转导域，两者偶联后构成穿膜抗体。本发明专利技术提供的膜抗体在蛋白转导域的作用下，被赋予细胞膜穿透能力，不但可以进入感染了病毒的靶细胞和靶器官，而且可在细胞内靶向病毒核心蛋白，通过抗原抗体高识别力、高亲和力的结合，阻断病毒的包装和复制，达到治疗病毒感染的目的。

【技术实现步骤摘要】
-种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体及其制备方法
[〇〇〇1] 本专利技术属于抗病毒治疗
，涉及一种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体及其制 备方法。
技术介绍
慢性病毒如HBV、HIV、HCV等感染严重危害人类健康，已成为国家重点防治的疾 病，病毒感染的治疗难题迫在眉睫。病毒寄生在宿主细胞内以复制的方式进行增殖。无论 是体液免疫还是细胞免疫，免疫作用机制是在细胞外液和细胞膜表面完成的。通过增强病 毒外膜抗原的免疫原性和突破宿主的免疫耐受来治疗和预防此类疾病的效果非常有限。如 何设计细胞内阻断病毒组装和复制的抗病毒免疫学方法成为亟待解决的问题。 既往抗病毒感染的研究取得很大进展，但仍不理想。抗病毒药物如细胞因子(干扰 素和胸腺肽等)，缺乏特异性，半衰期短，有效率仅为10%?30% ;核(苷)酸类似物、病毒复制 酶的抑制剂、鸡尾酒疗法大都对活跃复制的病毒有抑制作用，却不能清除潜伏状态或非复 制期的病毒，长期使用毒副作用大，易耐药、易复发。治疗性疫苗如蛋白质疫苗和DNA疫苗 治疗机制未完全明确、高效诱导免疫反应的疫苗难以设计，佐剂的选择、抗病毒药物联合使 用，疫苗安全性问题，以及过量诱导免疫应答造成的危害仍在试探与研究。 生物治疗的新理论、新方法如依赖核酸的基因治疗：RNAi技术、核酶、siRNA、 microRNA、核酸适配子、肽核酸技术等，在体外细胞内的研究显示能够有效地抑制病毒的复 制，但寡聚核酸合成困难、易被降解、导入困难、非特异性等缺点却难以克服。依赖蛋白质的 基因治疗，如胞内抗体、肽类适配子技术、抗病毒蛋白的转基因治疗等是在病毒蛋白的翻译 水平抑制病毒的复制。但该技术遇到的挑战是如何筛选和长期稳定表达针对病毒复制和转 化蛋白具有中和作用的细胞内抗体，并在细胞内还原条件下形成正确的结构。 基因治疗的载体作为外来抗原可激活机体的免疫应答使载体失活，载体导入也可 能会对人体造成严重的后果，细胞内真核表达抗体，会形成永久的基因改变。因此在整体水 平采用基因治疗的安全性评估成为最棘手的问题。因此，免疫治疗应该成为清除病毒最主 要的机制。既往清除病毒的免疫机制是针对病毒的外衣壳蛋白质抗原，刺激机体产生中和 性抗体和细胞毒性T细胞的结果。但HCV和HIV等由于病毒外衣壳蛋白质的免疫原性低和 免疫表位的结构域多变异等原因，难以制备具有中和作用的抗体发挥免疫预防和免疫治疗 的作用。目前依然不能成功建立清除病毒的免疫学治疗方法。 此类病毒的核心蛋白在病毒的生活周期中发挥着重要的作用，是病毒复制和包装 的不可获缺的重要组成部分，也是病毒细胞免疫的重要调控元件，并且核心蛋白具有变异 性小，免疫原性强的特点，病毒感染后能够持久产生高效价抗体。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供，该 方法适于不同的慢性病毒感染的治疗，比如HIV、HCV、HCMV、HPV、EB、HSV等等。 本专利技术是通过以下技术方案来实现： -种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体，其特征在于，包括相偶联的针对病毒核心蛋 白的抗体和蛋白转导域，两者偶联后构成穿膜抗体。 所述的针对病毒核心蛋白的抗体为单克隆抗体，所述的蛋白转导域为TAT、ant、 HSV VP22、PDX1、P印-1 或 TransportanlO 的穿膜肽；[〇〇11] 所述的针对病毒核心蛋白的抗体与蛋白转导域通过EDC偶联。 所述的针对病毒核心蛋白的抗体为针对HIV、HCV、HCMV、HPV、EB或HSV病毒的抗 体，所述的蛋白转导域为SEQ. ID. NO. 1所示的穿膜肽。 所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体抑制细胞病毒复制，并抑制细胞内、外病毒 的表达。 所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体为HBcMAb-TAT PTD，能够抑制细胞内、夕卜 HBsAg、HBeAg及细胞内HBcAg的表达，且存在剂量依赖关系。 一种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体的构建方法，包括以下步骤： 分别将针对病毒核心蛋白的抗体、蛋白转导域溶解后，加入到EDC溶液中，室温下 充分反应； 反应完成后加入饱和硫酸铵进行沉淀，4°C放置过夜，离心去上清，PBS缓冲液溶解 沉淀；将溶解产物放置于透析袋中，加入PBS缓冲液透析，3?4h更换一次透析液；更换3? 4次，直至透析完全；将透析的产物全部收回，得到靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体。 所述的针对病毒核心蛋白的抗体为HBcMAb，蛋白转导域为TAT。[〇〇19] 所制备的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体的转染方法，包括以下操作： 靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体与宿主细胞共孵育，然后加入含10%FBS和1%双抗 的DMEM高糖培养基，37°C，5%C0 2培养箱中培养2h ;用抗TAT-FITC荧光抗体的免疫荧光法 检测穿膜抗体穿膜效应，筛选有细胞内有荧光的细胞作为转染成功的细胞。 所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体在制备抗病毒感染的药物中的应用。 所述的药物为抑制病毒在细胞内外增殖和病毒DNA复制的药物。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果： 本专利技术提出以病毒核心蛋白作为抗病毒治疗的新靶点，使用化学偶联的方法α匕 如采用EDC)将病毒的核心抗体与蛋白质转导结构域（PTD)进行偶联，制备成具有抗病毒作 用的穿膜抗体。该穿膜抗体在蛋白转导域的作用下，被赋予细胞膜穿透能力，不但可以进入 感染了病毒的靶细胞和靶器官，而且可在细胞内靶向病毒核心蛋白，通过抗原抗体高识别 力、高亲和力的结合，阻断病毒的包装和复制，达到治疗病毒感染的目的。 本专利技术是使用蛋白质转导机制改造目前仅作为感染指标的病毒核心抗体，制备成 具有穿膜功能的治疗性抗体，达到抗病毒作用的目的，这是对感染免疫学理论的创新，同时 该抗体可进入细胞内抑制病毒组装和复制，使用了细胞内免疫机理，又是对系统抗感染免 疫机理的创新探索。 具体的本专利技术以HBV为研究对象，建立抗HBV感染的穿膜抗体细胞内抗病毒的免 疫学治疗新方法，结果表明HBcMAb-TAT穿膜抗体在Η印G2. 2. 15细胞培养液体中抗病毒结 果，细胞培养上清HBsAg、HBeAg、HBV DNA结果均显现出明显的剂量依赖关系，与阴性对照相 t匕，随着加入穿膜抗体浓度的增加，对ifepG2. 2. 15细胞病毒复制和蛋白表达不断降低，且 降低的程度逐渐加大，即抑制作用不断加大。BSA-TAT对照组和HBcAg对照组则未见到抑制 病毒复制和蛋白表达的作用。与阴性对照比，可见HBV DNA的抑制率和HBsAg、HBeAg抑制 率均随加入的穿膜抗体的浓度呈递增趋势。结果表明HBcMAb-TAT PTD体外细胞水平具有 明显的抗病毒作用。 HBcMAb-TAT穿膜抗体在Η印G2. 2. 15细胞裂解液体中抗病毒结果，细胞培养裂解 液中HBsAg、HBeAg、HBcAg、HBV DNA结果均显现出明显的剂量依赖关系，与阴性对照相比， 随着加入穿膜抗体浓度的增加，对Η印G2. 2. 15细胞内HBV DNA和HBsAg、HBeAg的表达不 断降低，且降低的程度随加入的穿膜抗体的量逐渐加大，即抑制作用不断加大。HBcAg则尤 其明显，20. 0 μ g/mL和40. 0 μ g/mL组HBeAg的量几乎无法检测到。而BSA-TAT对照组和 HBcAg对照组则没有作用。细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体，其特征在于，包括相偶联的针对病毒核心蛋白的抗体和蛋白转导域，两者偶联后构成穿膜抗体。

【技术特征摘要】
1. 一种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体，其特征在于，包括相偶联的针对病毒核心蛋白 的抗体和蛋白转导域，两者偶联后构成穿膜抗体。2. 如权利要求1所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体，其特征在于，所述的针对病毒 核心蛋白的抗体为单克隆抗体，所述的蛋白转导域为TAT、ant、HSV VP22、PDX1、P印-1或 TransportanlO 的穿膜肽； 所述的针对病毒核心蛋白的抗体与蛋白转导域通过EDC偶联。3. 如权利要求1所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体，其特征在于，所述的针对病毒 核心蛋白的抗体为针对HIV、HCV、HCMV、HPV、EB或HSV病毒的抗体，所述的蛋白转导域为 SEQ. ID. NO. 1所示的穿膜肽。4. 如权利要求1所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体，其特征在于，所述的靶向病毒 核心蛋白的穿膜抗体抑制细胞病毒复制，并抑制细胞内、外病毒的表达。5. 如权利要求4所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体，其特征在于，所述的靶向病毒 核心蛋白的穿膜抗体为HBcMAb-TAT PTD，能够抑制细胞内、外HBsAg、HBeAg及细胞内HBcAg 的表达，且存在剂量依赖关系。6. -种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体的构建方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亚文，李义平，刘正稳，惠凌云，刘希，冯艾，王威，张琳，杨广笑，王全颖，
申请(专利权)人：西安交通大学医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：陕西;61