水蛭胃蛋白酶酶解物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了水蛭胃蛋白酶酶解物及其应用，净选水蛭，粉碎成细粉；向水蛭细粉中加入人工胃液，然后加入胃蛋白酶水解，得到水蛭胃蛋白酶酶解物。水蛭胃蛋白酶酶解物具有抗凝血或溶栓的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到水蛭抗凝血和溶栓的活性成分及其应用。 水蛭胃蛋白酶酶解物及其应用
技术介绍
水輕（Hirudo)系水輕科动物蚂幢 Whitmania pigra Whitman、水輕 Hirudo nipponica Whitman 或柳叶蚂幢 Whitmania acranulata Whitman 的干燥全体。性咸、苦， 味平，有小毒，归肝经。具有破血通经、逐瘀消癥的作用，临床主要用于防治心脑血管疾病及 抗癌，已有研究表明活体水蛭的主要有效成分是水蛭素，药材中有效成分仍不清楚，因此目 前多以全粉末入药，存在着剂量大，易造成微生物污染等弊病。鉴于动物类蛋白质、粘多糖 等大分子物质只有到达胃肠道后受消化酶、酸、碱等作用，方可被酶解或者水解成小分子的 肽、低聚糖和其他小分子物质，吸收入血而发生药效，故生物酶仿生提取方法模拟体内消化 过程，提取的有效成分治疗效果更佳。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种抗凝血和溶栓的水蛭胃蛋白酶酶解物及其应用。 一种水蛭胃蛋白酶酶解物，由以下步骤组成的： A、 净选水蛭，粉碎成细粉； B、 向水蛭细粉中加入人工胃液，然后加入胃蛋白酶水解，得到水蛭胃蛋白酶酶解物。 水蛭胃蛋白酶酶解物，由以下步骤组成的： A、 净选水蛭，粉碎成细粉； B、 向水蛭细粉中加入人工胃液，水蛭细粉与人工胃液重量体积比为1:20，然后密闭于 43°C恒温水浴30分钟后，再加入2. 5%胃蛋白酶水解4小时，然后将酶解液置于85°C恒温水 浴15分钟，流水冷却至室温，以4000r/min离心15分钟，取上清液，干燥，得水蛭胃蛋白酶 酶解物。 水蛭胃蛋白酶酶解物，在制备抗凝血或溶栓药物中的应用。 为了验证水蛭胃蛋白酶酶解物的抗凝血和溶栓作用，作了如下实验： 水蛭胃蛋白酶解产物抗凝血和溶栓活性评价： 本专利技术采用活化部分凝血酶时间法(APTT法）和纤维蛋白原平板法对活性成分的抗凝 血和溶栓效果进行评价，评价方法如下： 1材料 1. 1药材 水蛭为全虫干燥体(石家庄以岭药业股份有限公司提供)，置干燥箱60°C以下干燥，粉 碎成细粉，备用。 1. 2 试剂 牛纤维蛋白原（Sigma F8630,购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）;胰蛋白酶1 : 250 (Amresco0458,购自北京华美转导科技有限公司）;胃蛋白酶1 :10000 (Sigma P7000,购 自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；医用注射性尿激酶(购自北京市望京医院）；凝血 酶（Sigma T4648,购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；活化部分凝血酶时间（APTT) 试剂10*1. 5ml (购自上海太阳生物试剂公司）;三氯乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公 司）；乙醇(分析纯)。 生理盐水(称取氯化钠 9g，加蒸馏水定容至1000ml，摇匀，即得）；人工胃液(取盐 酸9ml，加蒸馏水稀释成1000ml，即得）；人工肠液(取0. 2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加 0. 2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得)。 1.3 动物 健康的雄性日本大耳白兔，体重约2Kg(北京维通利华实验动物技术有限公司提供）， 符合国家健康一级动物标准。 1.4 仪器 UV-2000型分光光度计；800B型离心机(上海安亭科学仪器厂）；ES-120型电子分析天 平(长沙湘平科技发展有限公司）；恒温水浴锅(余姚市东方电工仪器厂）；DZ-1BC型真空干 燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司）。 2 方法 2. 1胃蛋白酶酶解法 取水蛭细粉，按1 : 20比例加入人工胃液(取盐酸9 mL，加蒸馏水稀释成1000 mL，即 得。pHl. 5。），密闭，于40 °C恒温水浴作用30 min后加入2%的胃蛋白酶，作用4 h后，将酶 解液置于85 °C恒温水浴作用15 min，流水冷却至室温后，以4000 i-mirT1离心15 min，取 上清（pHl. 5)，残渣备用。上清液分成两部分，一部分低温蒸干，为水蛭胃蛋白酶酶解物I ; 另一部分用NaOH溶液调pH4?5,离心，上清液低温蒸干，为水蛭胃蛋白酶酶解物II。 2. 2胰蛋白酶酶解法 取水蛭细粉，按1 : 20比例加入人工肠液(取0.2 mol吨4磷酸二氢钾溶液250 mL，力口 0.2 mol七1氢氧化钠溶液118 mL，用水稀释至1000 mL，即得)，密闭，于50 °C恒温水浴作 用30 min后加入4%的胰蛋白酶，作用5 h后，将酶解液置于85 °C恒温水浴作用15 min， 流水冷却至室温后，以4000 i-mirT1离心15 min，取上清液，低温蒸干，即得水蛭胰蛋白酶 酶解物。 2. 3仿生酶解法 水蛭粗粉先用胃蛋白酶酶解，所得酶解残渣再用胰蛋白酶酶解，既得水蛭仿生酶解物。 2. 5水煎提取法 水蛭粗粉（40目）8 g加水220 mL，煎煮2 h，离心，沉淀加水240 mL继续煮2 h，离心 去沉淀，合并两次离心的上清液，100 °C水浴加热浓缩至约15 mL，再次离心，上清液100 °C 水浴挥干，即得水蛭水提物。 3实验结果 3. 1样品液的制备 精密称取各种提取方法所得提取物适量，加入生理盐水，制成浓度为0. 2g (生药量）/ mL的样品。 3. 2 APTT 法 3. 2. 1血浆的制备 选用雄性日本大耳白兔，耳缘静脉注射戊巴比妥钠麻醉，颈动脉取血，加入3. 8 %枸 橼酸钠抗凝（1 : 9)，混勻后以3000r/min，离心15min，取上清液，分离出贫血小板血楽 (PPP)。 3. 2. 2测定步骤 在测试槽中，将已预温1〇11^11的4?1'1'试剂10(^1，与预温51^11的待测血浆（10(^1 PPP加样品液10 μ 1)混合，孵育5min后加入预温37°C的CaC12100 μ 1，同时计时，用针尖拨 动溶液，当有丝状凝结物被针挑起时，记录时间。 空白对照组：按上述方法取ΡΡΡ 100 μ 1，加入10 μ 1生理盐水和100 μ 1 ΑΡΤΤ试 齐[J，孵育5min后加入预温15min的CaC12100y 1，同时计时，记录凝结时间。每个样品平行 做6份。结果见表1。 表1各提取物APTT测定结果二6)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水蛭胃蛋白酶酶解物，其特征在于是由以下步骤组成的：A、净选水蛭，粉碎成细粉；B、向水蛭细粉中加入人工胃液，然后加入胃蛋白酶水解，得到水蛭胃蛋白酶酶解物。

【技术特征摘要】
1. 一种水蛭胃蛋白酶酶解物，其特征在于是由以下步骤组成的： A、 净选水蛭，粉碎成细粉； B、 向水蛭细粉中加入人工胃液，然后加入胃蛋白酶水解，得到水蛭胃蛋白酶酶解物。2. 根据权利要求1所述的水蛭胃蛋白酶酶解物，其特征在于是由以下步骤组成的： A、 净选水蛭，粉碎成细粉； B、 向水蛭细粉中加入人工胃液，水蛭细粉与人工胃液重量体积比为1:20，然后密闭于 43°C恒温水浴30分钟后...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓燕，赵韶华，王鑫国，王玉蓉，
申请(专利权)人：河北以岭医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13