本发明专利技术公开了一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法，属于生物技术领域。本发明专利技术所提供的方法是将经过分离、纯化的鸡骨骼肌成肌细胞和肌源成纤维细胞分别接种于Transwell培养皿的上室和下室，二者以1μm孔径的PET膜分开但共享添加有H2O2的成肌分化培养基；经过成肌分化诱导培养7-10天获得具有自主收缩能力的肌管，期间每隔8-12小时进行1次低温冲击刺激。本发明专利技术提供的方法能够显著提高鸡骨骼肌细胞的线粒体含量及其跨膜电位和有氧代谢酶的活性，同时降低了ATPase的活性。该方法具有培养周期短、效果稳定的特点，为研究鸡骨骼肌能量代谢规律、纤维类型形成机制等奠定了基础，具有良好的研究及应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物技术领 域。
技术介绍
骨骼肌的形成是一个连续的生理过程。胚胎期，骨骼肌成肌细胞增殖、分化、融合 为初级肌管并逐步成熟；出生后，肌纤维的数目虽然不再改变，但当肌肉组织受损时，静息 的卫星细胞被激活，进而分裂、融合形成新的肌管，骨骼肌得以再生。依靠现代细胞分离、培 养技术，研究人员能够利用胚胎成肌细胞或成体卫星细胞体外培养获得初级肌管。 动物的各种运动依赖于骨骼肌的收缩，而肌肉收缩所必需的能量均来源于ATP，骨 骼肌肌球蛋白Ca 2+- ATPase通过控制横桥ATP的分解速率，从而影响肌肉的张力和收缩速 度。Peter等（Peter等，1972)根据肌球蛋白ATPase的活性把骨骼肌纤维分为3种类型： 慢收缩氧化型（I型）、快收缩氧化酵解型（Ila型）和快收缩酵解型（lib型）：1型肌纤维 的线粒体含量丰富，有氧代谢酶活性高，主要通过有氧代谢获取能量，由于参与肌纤维收缩 的ATPase的活性较低，I型肌纤维收缩慢但持久；lib型肌纤维ATPase和无氧代谢酶的活 性较高，线粒体含量较少且有氧代谢酶的活性很低，主要依靠无氧代谢获取能量，因此lib 型肌纤维收缩快却不持久、易疲劳；Ila型肌纤维ATPase含量居中，既可以利用有氧代谢供 能，又可以依赖糖酵解供能。肌肉纤维的类型不仅决定着肌肉的代谢及运动特征，还影响其 色泽、嫩度、系水力等肉用品质。目前，对肌肉纤维类型及其代谢机制的的研究涉及农业生 产、医疗卫生、运动生理等众多领域。 尽管骨骼肌的分类及其特征已经明确，但各类型肌纤维的先天形成机制仍不清 楚，究其原因是现有研究结果及手段尚不能解析骨骼肌代谢模式建立的遗传机制。然而越 来越多的证据表明，后天因素也可以影响骨骼肌纤维的构成类型，如神经支配、持久性运动 训练、机械性负重、激素水平改变、肥胖、糖尿病、衰老等生理、病理变化均会导致肌纤维由 II型向I型或者由I型向II型转变（Pette和Staron2001 ;Zierath和Hawley2004)。体 内研究显示，肌纤维类型的转化受到多条信号通路的共同调控，包括Ras/MAPK信号通路、 腺苷酸激活的蛋白激酶信号通路、PGC-1 α / β通路、Myostatin和Wnt信号通路、CaN/NFAT 信号通路等（Rockl 等，2007 ;Takeda 等，2009 ;Hanke 等，2011)。 尽管体内实验可以更好地模拟机体的生理状态，但也给相关机制的研究增加了复 杂性。因此建立高效、稳定的骨骼肌细胞分离、培养甚至定向诱导体系将为进一步阐述骨骼 肌纤维形成、转化机制及其能量代谢规律奠定基础。上述问题的阐述也将为畜牧生产中家 畜肉质改良、医疗上骨骼肌功能性再生、竞技体育中运动生理学的研究提供有益参考。 虽然目前研究人员利用胚胎成肌细胞或成体卫星细胞进行体外培养可以获得肌 管，但所得肌纤维类型随机性强，氧化代谢能力普遍较低。并且，现有技术大都借助基因工 程手段进行特定基因的干扰或过表达可以引起动物骨骼肌纤维类型或氧化代谢水平的改 变（Semsarian等，1999 ;Lin等，2003 ;Shinichiro等，2008),尚未欠缺基于骨豁肌细胞非 转基因的定向诱导平台，为了进一步满足未来在医疗、畜牧业生产等领域应用的需要，骨骼 肌细胞非转基因定向诱导平台的建立更具有实际意义。
技术实现思路
本专利技术提供了，所采取的技术方 案如下： 本专利技术的目的在于提供，是从 鸡胚胎中分离纯化鸡骨骼肌成肌细胞和肌源成纤维细胞，将成肌细胞接种于Transwell Insert的PET膜上进行增殖培养，同时将肌源成纤维细胞经过传代培养后接种于 Transwell Insert培养皿上培养，再将经过增殖培养的成肌细胞转接入含有肌源成纤维细 胞的Transwell Insert培养皿中，加入含有H202的分化培养基进行分化培养。 所述方法的步骤如下： 1)成肌细胞和肌源成纤维细胞的分离纯化：从鸡胚胎中分离纯化骨骼肌成肌细 胞和肌源成纤维细胞； 2)成肌细胞的增殖培养：将步骤1)得到的成肌细胞接种到经过0. 1%明胶处理的 Transwell Insert的PET膜上，加入增殖培养基，获得增殖成肌细胞； 3)肌源成纤维细胞的培养：将步骤1)所得的肌源成纤维细胞进行3-5代传代纯 化培养后，接种到Transwell Insert培养皿内，37°C下培养Id后，去除培养基并用PBS清 洗； 4)将步骤2)所得的增殖成肌细胞转接入步骤3)的Transwell Insert培养皿中， 加入含有H202的分化培养基，培养期间每隔24-48h半量换液，每隔8-12h，进行1次低温冲 击刺激，分化培养后获得骨骼肌的多核肌管。 步骤1)所述鸡胚胎为孵化11日龄的鸡胚胎。 步骤2)所述成肌细胞，接种密度为5000个/cm2,所述PET膜为1 μ m孔径的PET 膜；所述增殖培养，所用培养基为含有10% FBS、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ug/ml 链霉素的高糖DMEM培养基；所述增殖培养，培养温度为37°C，培养时间为3-4d，C02体积浓 度为5%。 步骤3)所述接种到Transwell Insert培养皿中37°C下培养ld，成纤维细胞接种 密度为2000个/cm2,所用培养基为含有10% FBS、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的高糖 DMHM培养基。 步骤4)所述H202的浓度为20-80 μ Μ ;所述分化培养基为含有2%马血清、2mML-谷 氨酰胺、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的高糖DMEM培养基；所述低温冲击刺激是指将培 养物置于16°C低温孵育15-60分钟；所述培养，培养温度为37°C，C0 2体积浓度为5%，培养 时间为7-10d。 所述H202的浓度优选60 μ Μ ;所述16°C低温孵育，孵育时间优选30分钟。 所述方法的具体步骤如下： 1)成肌细胞和肌源成纤维细胞的分离纯化：从孵化11日龄的鸡胚胎中分离纯化 骨骼肌成肌细胞和肌源成纤维细胞； 2)成肌细胞的增殖培养：将步骤1)得到的成肌细胞以5000个/cm2的接种密 度接种到经过0. 1 %明胶处理的Transwell Insert的孔径为1 μ m的PET膜上，加入含有 10% FBS、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的高糖DMEM的增殖培养基，在 37°C、C0 2体积浓度为5%的条件下培养3-4d，获得增殖成肌细胞； 3)肌源成纤维细胞的培养：将步骤1)所得的肌源成纤维细胞进行3-5代传代纯 化培养后，以2000个/cm 2的接种密度接种到Transwell Insert培养皿内，用含有10% FBS、 100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的高糖DMEM培养基于37°C下培养Id后，去除培养基并用 PBS清洗； 4)将步骤2)所得的增殖成肌细胞转接入步骤3)的Transwell Insert培养皿中， 加入含有60 μ Μ的H202、2%马血清、2mML-谷氨酰胺、100U/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法，其特征在于，从鸡胚胎中分离纯化鸡骨骼肌成肌细胞和肌源成纤维细胞，将成肌细胞接种于Transwell Insert的PET膜上进行增殖培养，同时将肌源成纤维细胞经过传代培养后接种于Transwell Insert培养皿上培养，再将经过增殖培养的成肌细胞转接入含有肌源成纤维细胞的Transwell Insert培养皿中，然后加入含有H2O2的分化培养基进行分化培养。
【技术特征摘要】
1. 一种提高鸡骨骼肌细胞氧化代谢能力的培养方法，其特征在于，从鸡胚胎中分离纯 化鸡骨骼肌成肌细胞和肌源成纤维细胞，将成肌细胞接种于Transwell Insert的PET膜上 进行增殖培养，同时将肌源成纤维细胞经过传代培养后接种于Transwell Insert培养皿上 培养，再将经过增殖培养的成肌细胞转接入含有肌源成纤维细胞的Transwell Insert培养 皿中，然后加入含有H202的分化培养基进行分化培养。2. 权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 成肌细胞和肌源成纤维细胞的分离纯化：从鸡胚胎中分离纯化骨骼肌成肌细胞和 肌源成纤维细胞； 2) 成肌细胞的增殖培养：将步骤1)得到的成肌细胞接种到经过0.1 %明胶处理的 Transwell Insert的PET膜上，加入增殖培养基，获得增殖成肌细胞； 3) 肌源成纤维细胞的培养：将步骤1)所得的肌源成纤维细胞进行3-5代传代纯化培 养后，接种到Transwell Insert培养皿内，37°C下培养Id后，去除培养基并用PBS清洗； 4) 将步骤2)所得的增殖成肌细胞转接入步骤3)的Transwell Insert培养皿中，加入 含有H202的分化培养基，培养期间每隔24-48h半量换液，每隔8-12h，进行1次低温冲击刺 激，分化培养后获得骨骼肌的多核肌管。3. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述鸡胚胎为孵化11日龄的鸡胚胎。4. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述成肌细胞，接种密度为5000个/cm2， 所述PET膜为1 μ m孔径的PET膜；所述增殖培养，所用培养基为含有10% FBS、2mM L-谷氨 酰胺、l〇〇U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素的高糖DMEM培养基。5. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述增殖培养，培养温度为37°C，培养时 间为3-4d，C02体积浓度为5 %。6. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)所述接种到Transwell Insert培养皿中 37°C下培养ld，成纤维细胞接种密度为2000个/cm2,所用培养基为含有10% FBS、100U/ml 青霉素、100 μ g...
【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，李海，刘忠华，连正兴，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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