一种重组表达淀粉酶的工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物工程技术领域，具体涉及一种重组表达淀粉酶的工程菌及其应用。本发明专利技术通过将地衣芽孢杆菌的淀粉酶基因导入黑曲霉宿主细胞中，构建了重组表达该基因的黑曲霉工程菌。所述黑曲霉工程菌能高效表达淀粉酶，发酵酶活达1650U/mL。重组淀粉酶的最适作用pH为6.5，最适作用温度为55℃，为耐高温淀粉酶，可广泛用于食品添加剂领域，尤其是啤酒生产领域。

【技术实现步骤摘要】
一种重组表达淀粉酶的工程菌及其应用
本专利技术属于微生物工程
，具体涉及一种重组表达淀粉酶的工程菌及其应用。
技术介绍
淀粉酶是指能水解淀粉、糖原和有关多糖中的0-葡萄糖键的酶类总称，根据作用 的方式可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物。微 生物的酶几乎都是分泌性的。α -淀粉酶既可以作用于直链淀粉，也可作用于支链淀粉，无 差别的切断α-1，4_链。因此其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最 终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有少量麦芽三糖及少量葡萄糖。另一方 面，在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6_键的α-极限糊 精。β_淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1， 4-葡聚糖链。主要见于高等植物中，但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于像直链淀 粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖 的时候，切断至α-1，6-键的前面反应就停止了，因此，生产分子量比较大的极限糊精。 淀粉酶可广泛应用于麦芽糖、糖浆、糊精等的生产，在纺织工业中，淀粉酶可催化 织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产 品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。在酒精生产和酿酒工业中使用霉菌淀粉酶能有效提 高糖化率，酒精出率和酶母的生长。淀粉酶还可应用于出来淀粉生产过程中的废水，减轻对 环境的污染。因此现在对淀粉酶的研究成为热点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组表达淀粉酶的工程菌及其应用。本专利技术通过将来 源于地衣芽孢杆菌/icAefli/h/wis)的淀粉酶基因转化入黑曲霉 办·#)中，构建得到了高效重组表达淀粉酶的工程菌株，为实现淀粉酶的规模化生产奠定 基础。 本专利技术一方面涉及一种重组表达载体，其携带有编码淀粉酶的基因片段。 所述基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。 所述基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。 本专利技术另一方面提供了一种工程菌，其携带有上述重组表达载体。 所述工程菌，为黑曲霉 Amy Amy)。 所述工程菌在生产淀粉酶中的应用。 本专利技术通过将地衣芽孢杆菌的淀粉酶基因导入黑曲霉宿主细胞中，构建了重组表 达该基因的黑曲霉工程菌。所述黑曲霉工程菌能高效表达淀粉酶，发酵酶活达1650U/mL。 重组淀粉酶的最适作用pH为6. 5,最适作用温度为55°C，为耐高温淀粉酶，可广泛用于食品 添加剂领域，尤其是啤酒生产领域。利用本专利技术所述淀粉酶进行糊化，比传统的麦芽糊化方 法更简单，原料液化效果好，麦汁组成合理，啤酒理化指标和口感质量都得到明显改善，尤 其是麦汁得率大幅度提1?。 【附图说明】 图1为本专利技术所述淀粉酶作用pH-相对酶活曲线； 图2为本专利技术所述淀粉酶作用温度-相对酶活曲线。 【具体实施方式】 本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献 提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本专利技术限定于所述的任 何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。 除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本专利技术所属领 域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 3nd Ed (Singleton et al.，2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale et al.，2003)为技术人员提供了本专利技术中所使用的许多术语的一般性解释。 除非另作说明，核酸是按5'至:V方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的 方向从左至右书写。 如本文所用，术语重组当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核 酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此， 例如，重组细胞是表达在天然（非重组）形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基 因。 术语蛋白质和多肽在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的 单字母或三字母代码。 如本文所用，术语基因指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的 区域，以及各编码片段（外显子）之间的插入序列（内含子）。 术语核酸包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物。 术语核酸和多核苷酸在本文中可以互换使用。 术语载体指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载 体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。 术语表达载体表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接 于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录 的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增 强子以及控制转录和翻译的终止的序列。 术语启动子表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子 可以是诱导型启动子或组成型启动子。 与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个 序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。 由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸， 本专利技术包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。 术语宿主菌株或宿主细胞是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表 达载体或DNA构建物包含本专利技术的编码脂肪酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是 丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。 术语宿主菌株或宿主细胞指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。 下面结合具体实施例对本专利技术进行详细的描述。 实施例1淀粉酶基因的克隆 将地衣芽孢杆菌过夜培养，取1. 5ml，12000rpm离心1分钟，除上清；加入200 μ 1裂解 缓冲液（配方为：6〇11111^8-!1(：14!17.8，2〇1111恥-4(3，1111]\^0了4，1.5%505)，用移液器剧烈 吹打；加入66μ 1 5Μ高氯酸钠溶液混匀，12000rpm离心10分钟，取上清；加入等体积苯酚抽 提一次，12000rpm离心2分钟，取上清；加入等体积异丙醇沉淀5分钟，12000rpm离心5分 钟；70%乙醇洗涤两次；最后将干燥的DNA溶于ddH 20。 以上述提取的基因组总DNA为模板，利用引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为95°C 4min ;94°C 30S ;55°C 40S，72°C lmin 30 个循环；72°C 7min。利用凝胶回收试剂盒回收 PCR 扩增产物。 将回本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组表达载体，其携带有编码淀粉酶的基因片段。

【技术特征摘要】
1. 一种重组表达载体，其携带有编码淀粉酶的基因片段。2. 如权利要求1所述表达载体，其特征在于，所述基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 1〇3. 如权利要求2所述表达载体，其特征在于，所述基因编码的氨基酸序列为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佩佩，许丽红，王华明，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37