本发明专利技术一种桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术利用载体PFGC5941为框架，通过双酶切，在其内含子两边分别插入桔小实蝇钠离子通道基因的正反向特异性目的片段，构成RNA干扰载体非常重要的区域，构建的RNA干扰表达载体在转化到植株后，在其强启动子CaMV35S的驱动下，在其体细胞内转录形成双链RNA的“发卡结构”，使得桔小实蝇取食植株后体内同源基因片段的正常表达和翻译受到影响，实现干扰昆虫正常生长发育，达到植株抗桔小实蝇的目的，对桔小实蝇的控制发挥重要作用，减少化学农药使用量。
【技术实现步骤摘要】
桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体及其构建方法和 应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种RNA干扰载体，尤其涉及一种桔小实蝇 钠离子通道基因的RNA干扰载体及其构建方法和应用。
技术介绍
桔小实蝇Bactrocera dorsalis又名东方果实蝇，是一种世界危险性检疫害虫，广 泛分布于中国各大柑橘产区，使中国的柑橘产业面临着严重威胁，每年都对柑橘为害造成 巨大经济损失，能危害250多种瓜果蔬菜。桔小实蝇寄主范围广，可危害柑橘、芒果和杨桃 等250多种水果蔬菜和作物。随着气候变化、种植结构的调整和国际贸易的增加，其危害面 积逐渐扩大，给果蔬业带来严重的经济损失。目前化学防治仍是控制桔小实蝇的重要措施， 然而近年来对桔小实蝇种群抗药性监测表明，其抗药性上升非常快。 RNA干扰（RNA interference,RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默现象，它是 指通过双链RNA的介导的特异性的降解对应序列的mRNA，从而特异性地抑制相应基因的表 达，是植物对外来入侵者的一种重要的防御机制。基于RNA干扰技术获得抗昆虫的转基因 材料已在水稻、蔬菜和棉花等作物上取得成功。昆虫钠离子通道是神经细胞传导兴奋的基 础，同时，钠离子通道基因还与昆虫产生击倒抗性有关。目前还没有人将桔小实蝇钠离子 通道基因用于构建RNA干扰载体对桔小实蝇进行控制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体，该载体含有 桔小实蝇钠离子通道基因目的片段，得到的转基因植株可以使取食该植株的桔小实蝇发生 RNA沉默现象，使得转基因植株对桔小实蝇具有一定抗性。 本专利技术还提供干扰钠离子通道基因表达载体的构建方法和应用，为利用RNA干扰 技术的植物抗虫育种工程提供了一种新的策略和思路。 桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体，包括骨架载体和正、反义链，其特征在 于：以桔小实蝇钠离子通道基因部分片段为正或反义链，所述钠离子通道基因部分片段序 列如SEQ ID N0. 1，所述骨架载体为PFGC5941载体。 所述正义链插入在酶切位点Xhol和Ncol之间，反义链插入在酶切位点Xball和 BamHI之间。 桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体的构建方法，包括如下步骤： 1)钠离子通道基因目的片段与质粒的连接 提取桔小实蝇总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，以SEQ ID N0. 2和SEQ ID NO. 3为引物对钠离子通道基因的正向目的片段进行PCR扩增，以SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5为引物对钠离子通道基因的反向目的片段进行PCR扩增，得到PCR产物，目的片段约为 550bp，回收PCR产物，与载体pMD-19连接，转化大肠杆菌DH5 α得到重组质粒PMD-19-C1R1 和PMD-19-C2R2,进行序列验证，测序正确的目的片段即可用于RNA干扰载体的构建；所述 SEQ ID NO. 2?5的序列如下： SEQ ID N0. 2 :5, -GCCATGGCAGATGGTGATTTGCCTCGT-3,； SEQ ID NO. 3 :5' -CCATGGATATCGCCATGTATAGTGAA-3' ； SEQ ID NO. 4 :5' -GCTCTAGAGCCAGATGGTGATTTGCCTCGT-3' ； SEQ ID NO. 5 :5' -CGGGATCCATATCGCCATGTATAGTGAA-3' ； 2)钠离子通道基因的RNA干扰载体的构建 将上述测序正确的钠离子通道基因正向目的片段质粒pMD-19-ClRl与载体 PFGC5941分别用Xhol和Ncol双酶切，将pMD-19-ClRl与载体PFGC5941的酶切产物进行连 接得到插入正向目的片段的重组质粒PFGC5941-C1R1 ;将PFGC5941-C1R1和钠离子通道基 因反向目的片段质粒PMD-19-C2R2分别用Xball和BamHI双酶切，将酶切产物进行连接，即 可得到插入正、反义链的RNA干扰载体PFGC5941-C1R1/C2R2,经PCR扩增检测、核苷酸序列 分析，目的片段序列正确的干扰载体可用于农杆菌转化。 所述的桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体在转基因植物中的应用，所述转 基因植物为柑橘属植物。 所述应用为将桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体转化有关受体植物，使之 对桔小实蝇产生抗性，所述受体植物为柑桔。 所述转化的方法为农杆菌介导法。 所述农杆菌为农杆菌菌株EHA105。 本专利技术的有益效果是：本专利技术构建了含有桔小实蝇钠离子通道基因正反向目的片 段的RNA干扰载体以及该载体的构建方法和应用，本专利技术利用载体PFGC5941为框架，通过 双酶切，在其内含子两边分别插入桔小实蝇钠离子通道基因的正反向特异性目的片段，构 成RNA干扰载体非常重要的区域，为形成发卡结构提供结构基础。本专利技术构建的RNA干扰 表达载体在转化到植株后，在其强启动子CaMV35S的驱动下，可以在其体细胞内转录形成 双链RNA的发卡结构，使得桔小实蝇取食植株后体内同源基因片段的正常表达和翻译受 到影响，从而实现干扰昆虫正常生长发育的目的，达到植株抗桔小实蝇的目的，对桔小实蝇 的控制发挥重要作用，能够减少化学农药使用量，具有极其广阔的市场前景。载体PFGC5941 还携带能抗除草剂的Bar基因，为转基因苗的初步筛选提供标记基因。 【附图说明】 图1为提取的桔小实蝇总RNA的电泳图。M:DL5000Marker。 图2为钠离子通道基因正向反向目的片段的克隆电泳图。1、2是钠离子通道基因 正向片段电泳图；3、4是钠离子通道基因反向片段电泳图；M:DL5000Marker。 图3为钠离子通道基因正向反向目的片段插入载体PFGC5941位置示意图。 图4为载体PFGC5941经Xhol和Ncol酶切后的电泳图。1、2是载体PFGC5941 ;3、 4 是经 Xhol 和 Ncol 酶切后的载体 PFGC5941 ;M 是 DL5000Marker。 图5为钠离子通道基因正向片段经Xhol和Ncol酶切后的电泳图。1、2是经Xhol 和Ncol酶切后的钠离子通道基因正向片段；Μ是DL5000Marker。 图6为重组质粒PFGC5941-C1R1酶切后的电泳图。1为重组质粒PFGC5941-C1R1 ; 2 为经 Xbal 和 BamHI 酶切后的重组质粒 PFGC5941-C1R1 ;M 是 DL5000Marker。 图7为载体PFGC5941-C1R1/C2R2经Xbal和BamHI酶切后的电泳图。1、2是经 Xbal 和 BamHI 酶切后的重组质粒 PFGC5941-C1R1/C2R2 ;M 是 DL5000Marker。 图8为阳性转基因苗的PCR扩增检测电泳图。1是质粒PFGC-C1R1/C2R2对照；2 是清水对照；3-6是阳性扩增产物；Μ是DL5000Marker。 【具体实施方式】 大肠杆菌感受态细胞DH5 α (北京天根生化科技有限公司，中国本文档来自技高网...
【技术保护点】
桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体，包括骨架载体和正、反义链，其特征在于：以桔小实蝇钠离子通道基因部分片段为正或反义链，所述钠离子通道基因部分片段序列如SEQ ID NO.1，所述骨架载体为PFGC5941载体。
【技术特征摘要】
1. 桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体，包括骨架载体和正、反义链，其特征在 于：以桔小实蝇钠离子通道基因部分片段为正或反义链，所述钠离子通道基因部分片段序 列如SEQ ID NO. 1，所述骨架载体为PFGC5941载体。2. 根据权利要求1所述的桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体，其特征在于：所 述正义链插入在酶切位点Xhol和Ncol之间，反义链插入在酶切位点Xball和BamHI之间。3. 根据权利要求2所述的桔小实蝇钠离子通道基因的RNA干扰载体的构建方法，包括 如下步骤： 1) 钠离子通道基因目的片段与质粒的连接 提取桔小实蝇总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，以SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3为 引物对钠离子通道基因的正向目的片段进行PCR扩增，以SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5为引 物对钠离子通道基因的反向目的片段进行PCR扩增，得到PCR产物，目的片段约为550bp， 回收PCR产物，与载体pMD-19连接，转化大肠杆菌DH5 α得到重组质粒PMD-19-C1R1和 PMD-19-C2R2,进行序列验证，测序正确的目的片段即可用于RNA干扰载体的构建；所述SEQ ID NO. 2?5的序列如下： SEQ IDN0. 2 :5' -GCCATGGCAGATGGTGATTTGCCTCGT-3' ； SEQ ID NO. 3 :5' -CCATGGATATCGCCA...
【专利技术属性】
技术研发人员：冉春，岳建苏，刘浩强，丛林，李鸿筠，
申请(专利权)人：西南大学柑桔研究所，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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