基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法技术

本发明专利技术提供一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，包括细胞常规培养、细胞传代、细胞冻存、细胞复苏、将细胞进行染毒处理、进行形态学观察和细胞活性检测等步骤，本发明专利技术对于探讨纳米氧化锌的肠道毒性具有一定的理论意义，并为食品用纳米氧化锌限量标准的制定提供参考，为进一步研究食品用纳米氧化锌的安全问题提供可靠的科学依据，为其它纳米材料的安全性评价提供参考。为纳米氧化锌的安全使用提供理论支撑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品安全检测领域，具体是一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生 物安全性评价方法。
技术介绍
从当前的研究进展可知，活性氧自由基的产生引起机体氧化应激改变是现今所熟 知的纳米材料的毒性机制。从纳米材料的特性来看：粒径越小，其比表面积越大，反应的活 性位点就越多，更容易产生具有高反应能力的自由基。另外，不同纳米材料理化性质不同、 受测生物体中代谢活动有差异，因此不同纳米材料的致毒机制也不尽相同。除氧化应激机 制外，锌离子的释放、炎症反应应答和表面静电作用等因素都可参与其毒性作用。 活性氧自由基是是含有氧的化学反应分子，包括氧离子和过氧化物。作为正常代 谢反应的副产物，在信号转导，维持细胞内稳态方面起着重要作用。然而，在环境因子影响 下（比如紫外照射或者加热)。R0S水平显著增加。这可能导致细胞结构的明显的破坏，被称 做氧化应激反应。 正常状态下，细胞会通过A-1微球蛋白，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，乳糖过氧 化物酶，谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物还原蛋白来保护细胞免受氧化应激性损伤。其中 胞内的一些小分子物质例如维生素 C、维生素 E，尿酸和谷胱甘肽对于细胞抗氧化性也起重 要的作用。但在氧化应激条件下，活性氧自由基大量产生，对于细胞损伤主要包括：DNA损 伤、多不饱和脂肪酸氧化、氨基酸氧化和通过氧化辅酶因子使酶失活。最早的研究主要围绕 富勒烯的水悬浊液处理鱼脑组织产生氧化应激反应和脂质超氧化反应。进一步研究发现富 勒烯和其他无机的纳米材料(氧化锌、二氧化钛和氧化铜）也能引起氧化应激反应，在光照 刺激下可以产生更多的R0S，导致更严重的细胞毒性。Ye课题组发现金属铬通过还原反应 产生R0S参与细胞凋亡早期，p53蛋白可以与金属铬产生协同作用进入到细胞凋亡晚期。研 究已表明R0S是p53介导细胞凋亡信号通路的下游信号因子，金属铬可以诱导p53蛋白的 活化，做为肿瘤抑制蛋白，促进细胞凋亡。 锌是生物体必不可少的微量元素，机体有良好的调控体系可以平衡体内的锌，而 且锌离子本身化学性质显惰性，因此通常锌都被认为是无毒的。但纳米氧化锌作为金属毒 性中较强的一类纳米材料，引起了人们的关注。Kao等总结了纳米氧化锌释放Zn2+对细胞 产生的毒性机制。前期，纳米氧化锌通过内吞作用进入胞内的内含体，内含体在低浓度的pH 下，释放锌离子到细胞质中。到了后期，线粒体大量吸收锌离子，导致线粒体内的锌离子增 力口，致使线粒体膜破损，激活Caspase-3,产生凋亡同时释放LDH。 Brunner等采用多种金属氧化物染毒间脾瘤细胞MST0-211H和小鼠成纤维细胞 NIH/3T3。结果表明纳米氧化锌在进入细胞后，纳米氧化锌溶解出锌离子用于NIH/3T3毒 性。Wiseman等研究表明锌离子浓度的升高可以导致肺动脉内皮细胞线粒体损伤。同时表 明锌离子可以激活R0S大量产生，诱导的氧化损伤并进一步反馈于锌离子释放。Deniels研 究发现锌离子可以参与到MAP-激酶途径，产生活性氧，造成神经瘤细胞存活率降低，特别 是在高浓度的锌离子，4 h后即可明显观察到细胞抑制率升高。 在纳米复合材料的安全性评价中，有许多不确定性变量。主要存在以下问题：一、 关于染毒的剂量是纳米材料风险与危害评估的主要问题。在经典的毒性实验中，将细胞或 者组织暴露在一定剂量的染毒物，短时间内即可检测细胞的形态学变化、胞内外酶活的变 化，基因的差异性表达等。实验中的剂量效应是关键的因素，剂量可以用来评估药物治疗和 靶细胞或靶器官承受的浓度上限。大量的研究结果说明关于染毒物的剂量导致毒性一有毒 的物质在低浓度下是无毒的，无毒的物质在高浓度下也可以对机体产生危害。那么科学规 范的安全性评价就是采用科学公认的研究方法对纳米材料剂量、暴露途径和时间、确定粒 径大小和形状这些变量的进行详细描述，同时增加实验的可重复性。正在兴起的高通量和 计算机编程的方法应用于拍摄和表征纳米材料用于毒性检测，同时研究材料特征和生物习 性之间的关系。也为计算机研究人员提供了条件来设计合适的软件来描述纳米材料，还可 与毒理学家合作设计新的实验思路。既可以增加毒理实验的重复性，同时方便研究结果之 间相互比较。 根据 IS0(The International Organization for Standardization) ΙΟ3-5 国际 标准医疗器材的生物安全性评估一体外毒性的检测的毒性评价：毒性的效应可以分为定性 评价和定量评价。定性的毒性评价包括观察细胞形态，细胞的空泡化，细胞溶解，细胞膜完 整性，根据细胞的染毒程度可以分为无毒性、轻微毒性、中等毒性、严重毒性。定量的毒性评 价包括：检测细胞死亡、细胞生长抑制率、细胞增殖抑制率和克隆形成率。采用客观的方法 统计细胞数量，蛋白质数量，酶的释放，染料标记细胞。生物相容性检测对生物材料进行生 物安全性评价，纳米材料对宿主是异物，在体内必定会产生某些应答或出现排异现象。体外 分析方法或动物实验可以用于合理地预测在人体的反应，但目前还不能做到这一点。细胞 学检测是目前用于毒性评价、生物材料检测和环境材料接触检测的主要方法。尽管体外模 型与体内观察之间常在相关性和可预见性上欠佳，但目前还没有从材料合成到动物模型的 科学的判断标准。而且在细胞水平上的研究仍然知之甚少：纳米颗粒如何与细胞膜相互作 用，他们如何被转运进细胞、溶酶体、线粒体、细胞核，以及他们之间相互作用的结果。在人 体器官水平上，亟待解决的问题是纳米颗粒进入人体后的肺外转运和迁移的毒理动力学。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方 法。 一种，其特征在于包括如 下步骤： 1) 细胞常规培养：将Caco-2细胞培养于含有2. 9 mg/ml L-谷氨酰胺，1 mg/ml链霉 素，100 unit/ml青霉素，10%胎牛血清的DMEM完全培养基，每2天进行细胞换液，取对数期 Caco-2细胞进行实验； 2) 细胞传代：Caco-2细胞为贴壁细胞，培养3-4天后，细胞覆盖瓶底80%-90%时，采用 0. 25%胰酶37 °C消化，镜检观察，待少量细胞悬浮，多数细胞边缘透明时加入新培养基吹吸 进行终止消化，混合悬液以1/2 -1/3的比例进行分瓶传代； 3) 细胞冻存：细胞覆盖瓶底80% - 90%，采用胰酶消化成单细胞悬液，2000 rpm离心5分 钟，弃上清，缓慢加入冻存液，吹吸混匀，分装到灭菌冻存管中，可放入垫有棉花的泡沫盒中 直接-80°C超低温冰箱过夜，次日转移到液氮中冻存； 4) 细胞复苏：从液氮中取出冻存细胞，加入10 ml完全培养基混合，2000 rpm 5 min离 心，弃上清，再加入10 ml完全培养液培养，次日换液； 5) 将细胞进行染毒处理； 6) 进行形态学观察和细胞活性检测。 所述的一种，其特征在 于步骤5)中所述将细胞进行染毒处理包括如下步骤：取处于对数生长期的Caco-2,加入 0. 25%胰酶消化，细胞悬液为2 X 105/ml，200 μ 1接种于96孔板中，培养24 h，三种粒径的 纳米氧化锌按照稀释浓度6. 25,12.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Caco‑2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，其特征在于包括如下步骤：1）细胞常规培养：将Caco‑2细胞培养于含有2.9 mg/ml L‑谷氨酰胺，1 mg/ml 链霉素，100 unit/ml 青霉素，10% 胎牛血清的DMEM完全培养基，每2天进行细胞换液，取对数期Caco‑2细胞进行实验；2）细胞传代：Caco‑2细胞为贴壁细胞，培养3‑4天后，细胞覆盖瓶底80%‑90%时，采用0.25%胰酶37 ℃消化，镜检观察，待少量细胞悬浮，多数细胞边缘透明时加入新培养基吹吸进行终止消化，混合悬液以1/2—1/3的比例进行分瓶传代；3）细胞冻存：细胞覆盖瓶底80% ‑ 90%，采用胰酶消化成单细胞悬液，2000 rpm离心5分钟，弃上清，缓慢加入冻存液，吹吸混匀，分装到灭菌冻存管中，可放入垫有棉花的泡沫盒中直接‑80℃超低温冰箱过夜，次日转移到液氮中冻存；4）细胞复苏：从液氮中取出冻存细胞，加入10 ml完全培养基混合，2000 rpm 5 min离心，弃上清，再加入10 ml 完全培养液培养，次日换液；5）将细胞进行染毒处理；6）进行形态学观察和细胞活性检测。

【技术特征摘要】
1. 一种基于CaC〇-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，其特征在于包括如下 步骤： 1) 细胞常规培养：将Caco-2细胞培养于含有2. 9 mg/ml L-谷氨酰胺，1 mg/ml链霉 素，100 unit/ml青霉素，10%胎牛血清的DMEM完全培养基，每2天进行细胞换液，取对数期 Caco-2细胞进行实验； 2) 细胞传代：Caco-2细胞为贴壁细胞，培养3-4天后，细胞覆盖瓶底80%-90%时，采用 0. 25%胰酶37 °C消化，镜检观察，待少量细胞悬浮，多数细胞边缘透明时加入新培养基吹吸 进行终止消化，混合悬液以1/2 -1/3的比例进行分瓶传代； 3) 细胞冻存：细胞覆盖瓶底80% - 90%，采用胰酶消化成单细胞悬液，2000 rpm离心5分 钟，弃上清，缓慢加入冻存液，吹吸混匀，分装到灭菌冻存管中，可放入垫有棉花的泡沫盒中 直接_80°C超低温冰箱过夜，次日转移到液氮中冻存； 4) 细胞复苏：从液氮中取出冻存细胞，加入10 ml完全培养基混合，2000 rpm 5 min离 心，弃上清，再加入10 ml完全培养液培养，次日换液； 5) 将细胞进行染毒处理； 6) 进行形态学观察和细胞活性检测。2. 如权利要求1所述的一种基于Caco-2细胞对纳米氧化锌的生物安全性评价方法，其 特征在于步骤5)中所述将细胞进行染毒处理包括如下步骤：取处于对数生长期的Caco-2， 加入0. 25%胰酶消化，细胞悬液为2 X 105/ml，200 μ 1接种于96孔板中，培养24 h，三种粒 径的纳米氧化锌按照稀释浓度6. 25,12. 5, 25, 50和100 μ g/ml加入96孔板...

【专利技术属性】
技术研发人员：关荣发，康天舒，王彦波，伍义行，吕飞，张进杰，
申请(专利权)人：中国计量学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33