本发明专利技术提供一种沙门氏菌血清型鉴定方法，包括：1)提取待测样品中的DNA；2)将步骤1)获得的DNA作为模板，进行PCR检测，其中，PCR检测靶标为沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2；3)将步骤2)中的PCR产物进行序列测定；4)借助在线免费软件CRISPRfinder，寻找对应CRISPR的前三个间隔序列，并与各血清型标准间隔序列进行同源比对；5)比对结果的判断，可同时鉴定23种沙门氏菌常见血清型。本发明专利技术还提供了一种沙门氏菌血清型的鉴定试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2的引物，并提供23种沙门氏菌常见血清型的标准间隔序列表。
【技术实现步骤摘要】
一种沙门氏菌血清型鉴定方法及其试剂盒
本专利技术属于食品安全领域的核酸检测。具体而言，本专利技术涉及沙门氏菌血清型的 鉴定方法及试剂盒。
技术介绍
沙门氏菌（Salmonella)为杆状的革兰氏阴性肠道菌，兼性耗氧，大多数菌株可在 没有特殊生长因子的合成培养基上生长。沙门氏菌是极其重要的食源性致病菌，对人类和 动物都具有极大危害，而且能够在人体与动物体间进行传播。近几十年来，由沙门氏菌引起 的食物中毒占世界食物中毒病例的第一或第二位。我国每年发生的细菌性食物中毒事件占 食物中毒事件总数的30%-90%，中毒人数占食物中毒总人数的60% -90%，而在细菌性食 物中毒的病原中，沙门氏菌约为40%。沙门氏菌血清型的种类繁多，目前已达两千多种，有 些沙门氏菌血清型与其致病性息息相关，而有些血清型并不致病。常见的食物中毒主要由 一些特定的血清型感染引起，如肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、德尔比 沙门氏菌等，因此对于研究沙门氏菌的致病机理及流行病学监测，血清型的鉴定是十分必 要的。 当前，我国对于沙门氏菌的检测主要是依靠国标（GBT4789. 4-2010)的方法，根据 沙门氏菌的生化反应，以及抗原抗体反应进行分型鉴定。但是此方法存在一些缺陷，抗原和 分型血清的制备比较复杂，另外，沙门氏菌的抗原与血清的凝集反应有时较为迟缓，反应较 弱，易造成错误的分型结果。有些分子分型方法如脉冲场凝胶电泳（PFGE)、多位点序列分型 (MLST)等，其分型结果也可以与不同血清型对应起来，但是PFGE法操作较为繁琐，对于操 作者的技术水平要求很高，而MLST法需要同时扩增七个看家基因并进行测序和序列分析， 耗时较长，成本较 建立一种行之有效的食源性沙门氏菌血清型的鉴定方法，以提高其血清型鉴定的 速度和准确度，使受污染的食品得到及时处理，在公共卫生、食品安全和口岸检疫中都有重 要意义。 最近发现，在细菌和古菌中广泛存在着成簇规律间隔短回文重复序列，即CRISPR。 沙门氏菌通常含有两个CRISPR系统，S卩CRISPR1和CRISPR2,它可以使细菌对噬菌体或质粒 等外源DNA实现免疫，而CRISPR系统中的间隔序列在免疫过程中发挥着重要作用，是用来 识别外源DNA的标签，不同的间隔序列与不同噬菌体或质粒上的序列存在高度同源性。同 时，在细菌进化过程中间隔序列存在插入和选择性剔除的现象，使其具备多态性，进而在不 同菌株间存在特征性的差异。 为此，本专利技术人经过长期研究，令人意外地研究出了一种基于沙门氏菌CRISPR1 和CRISPR2前三个间隔序列保守性的沙门氏菌血清型快速鉴定方法。 这种沙门氏菌血清型快速鉴定方法针对沙门氏菌血清型CRISPR位点中间隔序列 特异性强，可有效区分沙门氏菌不同血清型，快速、灵敏，并可以应用于食源性沙门氏菌不 同血清型的鉴定。
技术实现思路
有鉴于现有技术存在上述的问题，本专利技术的目的是提供一种快速、灵敏的沙门氏 菌血清型鉴定方法。为此，本专利技术的技术方案为：一种沙门氏菌血清型的鉴定方法，包括以 下步骤： 1)提取待检测样品中的DNA ; 2)将步骤1)获得的DNA作为模板，进行PCR检测；其中，PCR检测的靶标为沙门氏 菌 CRISPR1 和 CRISPR2 ; 3)将步骤2)中的PCR产物进行序列测定； 4)借助在线免费软件CRISPRfinder，寻找对应CRISPR位点的前三个间隔序列，并 与各血清型标准间隔序列进行同源比对； 5)比对结果的判断：样品的CRISPR1和CRISPR2的间隔序列分别与某一标准血清 型的CRISPR1和CRISPR2间隔序列至少有两个一致则判定为对应的血清型。 其中蒙得维亚沙门氏菌和伤寒沙门氏菌由于CRISPR2基因的扩增产物拷贝数过 低或扩增产物片段太小，在测序时不能得出正确的序列信息，而通过多次分离株的验证，发 现其CRISPR1基因的前三个间隔序列已经具有较强的血清型特异性，能够作为血清型鉴别 的依据，故只需比对CRISPR1基因的前三个间隔序列即可。 本专利技术之所以选CRISPR1和CRISPR2的前三个间隔序列作为检测靶标是通过如下 方法筛选得到的： 选取23种不同血清型，每种血清型各有几种不同的标准菌株，利用CRISPR1和 CRISPR2 的对应的引物 CRISPR1-F，CRISPR1-R 和 CRISPR2-F，CRISPR2-R，进行 PCR 扩增， 可以得到不同大小的CRISPR1和CRISPR2片段，其中同一血清型的片段大小相近，不同血 清型的片段大小差异明显，将PCR产物送商业测序公司测序，测得序列利用在线免费软件 CRISPRfinder(http://crispr. u-psud. fr/Server/)分析，找出 CRISPR1 和 CRISPR2 各自的 重复序列和间隔序列，重复序列一般为5' -CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACAC-3'，然而间隔 序列的差异较大，其中差异主要分为两个方面：第一个方面，在相同沙门氏菌血清型的菌株 中，间隔序列的数目有差别，如肠炎沙门氏菌的CRISPR2中普遍含有十个间隔序列，但是有 部分的菌株在菌株进化过程中缺失了或者增加了间隔序列，因此造成同一血清型沙门氏菌 菌株之间的差异，但是最为重要的一点是，相同沙门氏菌血清型的菌株之间开头的间隔序 列的碱基序列是相同的，也是特异的。第二个方面，在不同沙门氏菌血清型的菌株之间，不 论在间隔序列的数目上以及在间隔序列的碱基序列上均有很大差异，尤其是间隔序列的碱 基序列，在不同血清型的菌株间没有共有的。综上，根据相同沙门氏菌血清型菌株间隔序 列的碱基序列的共性，不同沙门氏菌血清型菌株之间间隔序列的碱基序列的差异性，选取 CRISPR的前三个间隔序列作为鉴别沙门氏菌不同血清型的靶标序列。 建立不同血清型沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2前三个间隔序列的序列库。待检测 的菌株CRISPR1和CRISPR2前三个间隔序列与序列库中前三个间隔序列比对，与某一标准 血清型的前三个间隔序列中至少两个一致即判定为对应的血清型。 这种新的沙门氏菌血清型鉴定方法的CRISPR1和CRISPR2的引物是通过公用 CRISPR数据库检索下载并海量搜集CRISPR1和CRISPR2的上下游侧翼序列，BLAST比对 CRISPR1和CRISPR2的侧翼序列，分别得到保守的上下游的碱基序列，利用primer5. 0设计 出引物 CRISPR1-F 和 CRISPR1-R，CRISPR2-F 和 CRISPR2-R。 在本专利技术中，样品是潜在含有沙门氏菌菌株的离体样品，包括食品、血液、血液制 品、唾液、医疗用品或药品等。由于沙门氏菌是食源性致病菌，检测来自于食品的样品，属食 品安全检测领域。提取DNA以及PCR检测中所用的试剂和仪器已经为本领域技术人员所掌 握，而且目前有大量商品化的试剂和仪器可供选用。例如，在本专利技术的【具体实施方式】中，可 以使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒来提取菌体基因组DNA，可以使用普通的PCR仪完成PCR 检测。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种沙门氏菌血清型鉴定方法，其特征在于，包括步骤：1)提取待检测样品中的DNA；2)将步骤1)获得的DNA作为模板，进行PCR检测；其中，PCR检测的靶标为沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2；3)将步骤2)中的PCR产物进行序列测定；4)借助在线免费软件CRISPRfinder，寻找对应CRISPR位点的前三个间隔序列，并与各血清型标准间隔序列进行同源比对；5)比对结果的判断：样品的CRISPR1和CRISPR2的间隔序列分别与某一标准血清型的CRISPR1和CRISPR2间隔序列至少有两个一致则判定为对应的血清型；其中，蒙得维亚沙门氏菌和伤寒沙门氏菌只需比对CRISPR1基因的前三个间隔序列即可。
【技术特征摘要】
1. 一种沙门氏菌血清型鉴定方法，其特征在于，包括步骤： 1) 提取待检测样品中的DNA ; 2) 将步骤1)获得的DNA作为模板，进行PCR检测；其中，PCR检测的靶标为沙门氏菌 CRISPR1 和 CRISPR2 ; 3) 将步骤2)中的PCR产物进行序列测定； 4) 借助在线免费软件CRISPRfinder，寻找对应CRISPR位点的前三个间隔序列，并与各 血清型标准间隔序列进行同源比对； 5) 比对结果的判断：样品的CRISPR1和CRISPR2的间隔序列分别与某一标准血清型的 CRISPR1和CRISPR2间隔序列至少有两个一致则判定为对应的血清型； 其中，蒙得维亚沙门氏菌和伤寒沙门氏菌只需比对CRISPR1基因的前三个间隔序列即 可。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中检测CRISPR1所 GAGTATGGTGGTTGTGGT-3' 。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中检测CRISPR2所用的引物为： CRISPR2-F :5'-CTGTATAAAAGCCTCCCC-3' 和 CRISPR2-R :5'-GTTGGTAGAATGTGGTGC-3'。4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中检测CRISPR1所用PCR的扩 增条件为：95°C预变性10min，95°C变性lmin，60. 5°C退火lmin，72°C延伸lmin，进行35个 循环，最后72°C延伸lOmin。5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中检测CRISPR2所用PCR的扩 增条件为：95°C预变性10min，95°C变性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸lmin，进行35个循 环，最后72°C延伸lOmin。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沙门氏菌为以下23种中的一种：鼠伤 寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium)、肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis)、婴儿沙 门氏菌（Salmonella Infantis)、猪霍乱沙门氏菌（Salmonella Ch...
【专利技术属性】
技术研发人员：施春雷，庄孝飞，周秀娟，史贤明，崔妍，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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