同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒及病原体检测方法技术

本发明专利技术提供了一种可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，包括各病原体的特异性引物、各病原体的基因探针。本发明专利技术的上述可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术之上，采用特异性设计的病原体引物和病原体基因探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。

【技术实现步骤摘要】
同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的 试剂盒及病原体检测方法
本专利技术属于病毒检测试剂盒
，具体涉及一种同时检测副流感病毒1至4 型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒及病原体检测方法。
技术介绍
流感的某些病状多是由于副流感病毒1-4型、冠状病毒229E和鼻病毒中的一种或 者几种共同感染引起，比如在所有病原体感染的呼吸道疾病中1. 9%感染了多种细菌类病 原体，2. 1 %感染了多种病毒类病原体，15. 2%共感染了细菌和病毒类病原体。而现有的对 于引起上述病状病原的检测多采用两种：1)通过组织培养：对细胞中的病毒或直接检测存 在于呼吸道分泌物中的病毒进行分离提取，使用免疫荧光实验、PCR、酶联免疫反应测定等 方法进行逐一检测；2)针对病菌感染后检测在血清中产生的IgG特异性抗体或检测单一血 清标本中特异性抗体IgM，通过特异性抗体的结果便逆推特异性的病原的类型。 上述检测方法，一次只能检测一种病原体，通过重复多次实现所有病原体的检测。 临床上，引起感染症状的病原体可能多达几十种，如果采用传统的方法，则要进行几十个 PCR反应，工作量巨大，耗时较长，很可能会耽误控制疾病蔓延的时机。所以，为了节约成本 的需要，一种准确有效的能同时检查多种疾病的技术的出现，变得非常必要。2006年旅美华 人韩健博士专利技术了 Tem-PCR(Target enriched multiplex PCR，祀序列富集多重PCR技术） 能在一次反应中对多重靶序列进行高灵敏度和特异性的扩增和检测，为MDD(molecular differential diagnoses,分子鉴别诊断）带来革命性的变化。其利用多色突光检测是通过 对不同靶特异的检测探针标记不同波长的荧光基团，使不同的探针实现彼此的区分，从而 根据实时PCR各探针荧光信号的升起的情况对不同靶的进行检测，从而通过这一技术实现 多种病原体的同时检测。但是，在实施中PCR仪中可检测的单色荧光通道数目毕竟有限，最 多可以有3-5个，因此在使用中无法满足一次进行更多种病原体的同时检测。而且进一步 地Tem-PCR仍有一些不足之处，比如在实施过程中，当几种荧光标记共同混合时产生敏感 性低于real-time PCR，扩增时间较传统PCR长，检测时打开PCR反应管造成实验室污染和 假阳性的可能，以及靶基因的扩增和检测尚未一体化等。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种在不增加单色荧光 管通道下，能够快速、高灵敏度地同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的 试剂盒。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术实施例的技术方案如下： -种同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，包括： 副流感病毒 1 型上游引物 5' -GAGATCTCACACAATTAATAGAGAAGTCA-3' ； 副流感病毒 1 型下游引物 5' -CCTACGGGACATCTCCAGAA-3' ； 副流感病毒 2 型上游引物 5' -ACCTAAGTGATGGAATCAATCGC-3' ； 副流感病毒 2 型下游引物 5' -TGCCCTGTTGTATTTGGAAGAGAT-3' ； 副流感病毒 3 型上游引物 5' -TGTTGAGCCTATTTGATACATTTAAGC-3' ； 副流感病毒 3 型下游引物 5' -ATGATAGCTCCACCAGCTGATTTT-3' ； 副流感病毒 4 型上游引物 5' -CCTGGAGTCCCATCAAAAGT-3' ； 副流感病毒 4 型下游引物 5' -GCATCTATACGAACACCTGCT-3' ； 冠状病毒 229E 上游引物 5' -ATGGCTACAGTCAAATGGGC-3' ； 冠状病毒 229E 下游引物 5 ' -CACTATCAACAAGCAAAGGGCTATAA-3 ' ； 鼻病毒上游引物 5 ' -TGGACAGGGTGTAAAGAGC-3 ' ； 鼻病毒下游引物 5' -GCATCTATACGAACACCTGCT-3' ； 病原体基因探针包括： 副流感病毒1型基因探针 5，-AAT TGG CTC AGA TAT GCG A (G/A) A ACA C-3，； 副流感病毒2型基因探针 5，-TGT TCA GTC ACT GCT ATA CCA GGA G-3，； 副流感病毒 3 型基因探针 5 ' -CGT AGG CAA GAA AAC ΑΤΑ Α-3 ' ； 副流感病毒4型基因探针 5, -ACAATTACACTTGA TCCGTTAGCAAGACCCAT-3,； 冠状病毒229E基因探针 5 ' -CAC AAC GTG GTC GTC AGG GTA GAA TA-3 ' ； 鼻病毒基因探针 5' -TCC TCC GGC CCC TGA ATG-3'。 本专利技术的上述可同时检测副流感病毒1-4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒， 基于多重荧光实时PCR和Tem-PCR技术之上，采用特异性设计的病原体引物和病原体基因 探针，进行RT-PCR，可以大大提高了扩增效率，从而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使检测结 果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵敏度低的问题。 本专利技术进一步还提出一种利用可同时检测副流感病毒1-4型、冠状病毒229E和鼻 病毒的试剂盒进行病原体检测方法，包括如下步骤： 提取病患标样中的病原体核酸； 将试剂盒中病原体特异性引物用通用引物进行同源加尾； 将病原体基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述病原体基 因探针标记的荧光标记物为一种或多种，且不同病原体基因探针上标记的荧光信号不相 同； 将提取的病原体核酸、荧光标记后的病原体基因探针、同源加尾后的病原体特异 性引物混合、并添加缓冲液制成混合反应系； 将混合反应系进行RT-PCR，并检测反应过程中荧光信号。 采用本专利技术的可同时检测副流感病毒1-4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒的 病原体检测方法，以试剂盒为基础，采用荧光对探针进行多色组合探针编码，替代现有的单 色荧光标记探针方法，提高了单一反应管中可识别的探针的数目，从而提高实时PCR单管 中能够检测的靶的数目；然后进一步在检测过程中用特异性引物同源加尾通用引物形成加 尾引物进行RT-PCR反应，且特异性引物设计其两端存在互补tag序列，因此引物的各单链 两端互补会各自形成一个稳定的发夹结构，而不会随着PCR过程的进行成为通用引物扩增 的模板，从而大大的降低了引物二聚体的产生；提升了反应效率，也使得用普通的TaqDNA 聚合酶仍能使检测结果具有很高的检测灵敏度，解决了传统多重PCR扩增效率低和检测灵 敏度低的问题。 【附图说明】 下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中： 图1为本专利技术实施例阳性对照检测中六重荧光标记的RT-PCR扩增曲线； 图2为本专利技术实施例阳性对照检测中副流感病毒1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，其特征在于，包括病原体特异性引物和病原体基因探针；其中，所述病原体特异性引物包括：副流感病毒1型上游引物5’‑GAGATCTCACACAATTAATAGAGAAGTCA‑3’；副流感病毒1型下游引物5’‑CCTACGGGACATCTCCAGAA‑3’；副流感病毒2型上游引物5’‑ACCTAAGTGATGGAATCAATCGC‑3’；副流感病毒2型下游引物5’‑TGCCCTGTTGTATTTGGAAGAGAT‑3’；副流感病毒3型上游引物5’‑TGTTGAGCCTATTTGATACATTTAAGC‑3’；副流感病毒3型下游引物5’‑ATGATAGCTCCACCAGCTGATTTT‑3’；副流感病毒4型上游引物5’‑CCTGGAGTCCCATCAAAAGT‑3’；副流感病毒4型下游引物5’‑GCATCTATACGAACACCTGCT‑3’；冠状病毒229E上游引物5’‑ATGGCTACAGTCAAATGGGC‑3’；冠状病毒229E下游引物5’‑CACTATCAACAAGCAAAGGGCTATAA‑3’；鼻病毒上游引物5’‑TGGACAGGGTGTAAAGAGC‑3’；鼻病毒下游引物5’‑GCATCTATACGAACACCTGCT‑3’；所述病原体基因探针包括：副流感病毒1型基因探针5’‑AAT TGG CTC AGA TAT GCG A(G/A)A ACA C‑3’；副流感病毒2型基因探针5’‑TGT TCA GTC ACT GCT ATA CCA GGA G‑3’；副流感病毒3型基因探针5’‑CGT AGG CAA GAA AAC ATA A‑3’；副流感病毒4型基因探针5’‑ACAATTACACTTGA“T”CCGTTAGCAAGACCCAT‑3’；冠状病毒229E基因探针5’‑CAC AAC GTG GTC GTC AGG GTA GAA TA‑3’；鼻病毒基因探针5’‑TCC TCC GGC CCC TGA ATG‑3’。...

【技术特征摘要】
1. 一种可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，其特征在 于，包括病原体特异性引物和病原体基因探针； 其中，所述病原体特异性引物包括： 副流感病毒 1 型上游引物 5' -GAGATCTCACACAATTAATAGAGAAGTCA-3' ； 副流感病毒1型下游引物5' -CCTACGGGACATCTCCAGAA-3' ； 副流感病毒 2 型上游引物 5' -ACCTAAGTGATGGAATCAATCGC-3' ； 副流感病毒 2 型下游引物 5' -TGCCCTGTTGTATTTGGAAGAGAT-3' ； 副流感病毒 3 型上游引物 5' -TGTTGAGCCTATTTGATACATTTAAGC-3' ； 副流感病毒 3 型下游引物 5' -ATGATAGCTCCACCAGCTGATTTT-3' ； 副流感病毒4型上游引物5' -CCTGGAGTCCCATCAAAAGT-3' ； 副流感病毒4型下游引物5' -GCATCTATACGAACACCTGCT-3' ； 冠状病毒 229E 上游引物 5' -ATGGCTACAGTCAAATGGGC-3' ； 冠状病毒 229E 下游引物 5' -CACTATCAACAAGCAAAGGGCTATAA-3' ； 鼻病毒上游引物 5 ' -TGGACAGGGTGTAAAGAGC-3 ' ； 鼻病毒下游引物 5' -GCATCTATACGAACACCTGCT-3' ； 所述病原体基因探针包括： 副流感病毒1型基因探针 5 ' -AAT TGG CTC AGA TAT GCG A (G/A) A ACA C-3 ' ； 副流感病毒2型基因探针 5, -TGT TCA GTC ACT GCT ATA CCA GGA G-3,； 副流感病毒3型基因探针5' -CGT AGG CAA GAA AAC ΑΤΑ Α-3' ； 副流感病毒4型基因探针 5, -ACAATTACACTTGA T，，CCGTTAGCAAGACCCAT-3,； 冠状病毒229E基因探针 5' -CAC AAC GTG GTC GTC AGG GTA GAA TA-3' ； 鼻病毒基因探针 5' -TCC TCC GGC CCC TGA ATG-3'。2. 如权利要求1所述的可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试 剂盒，其特征在于，还包括阳性对照； 所述阳性对照包括连有副流感病毒1型基因片段的载体、连有副流感病毒2型基因片 段的载体、连有副流感病毒3型基因片段的载体、连有副流感病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：房师松，张然，张仁利，
申请(专利权)人：深圳市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广东;44