一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法及其产品技术

本发明专利技术公开一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法，包括：i)在宿主菌细胞内转入编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因，并使其高表达；ii)在宿主菌细胞内转入编码γ-谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因，并使其高表达；iii)敲除宿主菌细胞的γ-谷氨酰转肽酶基因；iv)敲除宿主菌细胞的肌醇-3-磷酸合酶基因；所述i)、ii)、iii)、iv)以任意顺序操作完成后即得所述用于合成谷胱甘肽的基因工程菌；本发明专利技术还涉及所制得的基因工程菌；本发明专利技术提供的用于合成谷胱甘肽的基因工程菌不仅高效合成谷胱甘肽，也可以大大提高外源半胱氨酸的转化效率，可用于生产谷胱甘肽。

【技术实现步骤摘要】
一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法及其产品
本专利技术涉及生物工程领域，特别是涉及一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法及其产品。
技术介绍
谷胱甘肽(Glutathione,GSH)，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是一种由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成的，广泛存在于生物体内的生物活性三肽化合物(MeisterA,AndersonME.Glutathione.AnnuRevBiochem,1983,52:711–760)。在所有生物中，谷胱甘肽以两种存在形式，即还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，其中在机体内起主要作用的还原型谷胱甘肽占多数(AkerboomTP,BilizerMM,SiesH.TherelationshipofbiliaryGSSGeffluxandintracellularGSSGcontentinperfusedratliver.JBiolChem,1982,257:4248–4252)。谷胱甘肽在体内具有抗氧化、清除自由基、抑制HIV等功能(CarmelHO,StorzG.Rolesoftheglutathioneandthioredoxin-dependentreductionsystemsintheEscherichiacoliandSaccharomycescerevisiaeresponsestooxidativestress.AnnuRevMicrobiol,2000,54:439–461；JahoorF,JacksonA,GazzardB,etal.Erythrocyteglutathionedeficiencyinsymptom-freeHIVinfectionisassociatedwithdecreasedsynthesisrate.JAmJPhysio,1999,276(1):E205-E211)。目前，已被广泛的应用于医药、化妆品、食品加工等领域。谷胱甘肽作为重要的生物活性物质，目前文献报道在生物体内主要有3条生物合成途径：I.标准途径在大多数真核细胞和革兰氏阴性细菌中，谷胱甘肽的生物合成主要通过两步依赖于ATP的酶催化反应(MeisterA.Glutathionemetabolismanditsselectivemodification.JBiolChem,1988,263:17205–17208)：(1)L-谷氨酸和L-半胱氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(gamma-glutamylcysteinesynthetase，γ-GCS,orGSHI)的作用下合成γ-谷氨酰半胱氨酸；(2)γ-谷氨酰半胱氨酸在谷胱甘肽合成酶(glutathionesynthetase,GS,orGSHII)的作用下，与甘氨酸反应生成谷胱甘肽。两步反应如下：L-Glutamate+L-cysteine+ATP→L-γ-Glutamyl-L-cysteine+ADP+Pi(反应1)L-γ-Glutamyl-L-cysteine+glycine+ATP→GSH+ADP+Pi(反应2)在谷胱甘肽的合成过程中，γ-GCS受到终产物GSH的反馈抑制，以避免过度积累，且γ-GC的形成为该途径的限速步骤(MurataK,KimuraA.Overproductionofglutathioneanditsderivativesbygeneticallyengineeredmicrobialcells.BiotechnolAdv,1990,8:59–96)。II.双功能酶途径在一些致病性的革兰氏阳性细菌中，如无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、李斯特菌(ListeriaMonocytogenes)、巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)存在一种谷胱甘肽合成酶—γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-谷胱甘肽合成酶(γ-GCS-GS，Gshf)，该酶为一个双功能酶，同时具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的催化活性，可以单独催化谷胱甘肽的生成(GopalS,BorovokI,OferA,etal.AmultidomainfusionproteininListeriamonocytogenescatalyzesthetwoprimaryactivitiesforglutathionebiosynthesis.JBacteriol,2005,187:3839–3847；JanowiakBE,GriffithOW.GlutathionesynthesisinStreptococcusagalactiae.Oneproteinaccountsforgamma-glutamylcysteinesynthetaseandglutathionesynthetaseactivities.JBiolChem,2005,280:11829–11839；VergauwenB,DeVosD,VanBeeumenJJ.Characterizationofthebifunctionalgamma-glutamate-cysteineligase/glutathionesynthetase(GshF)ofPasteurellamultocida.JBiolChem,2006,281:4380–4394)。γ-GCS-GS功能蛋白的大小与γ-GCS和GS这两个酶的酶蛋白大小之和类似。因此，在生物进化上存在着一定的进化关系；但该酶对GSH的反馈抑制不敏感，GSH生物合成的反应过程也类似于上述2个独立的功能蛋白酶催化的反应过程。III.替代途径大多数好氧性细菌中不含有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的功能基因，但其仍能完成谷胱甘肽的生物合成，满足生命活动的需要。因此，在其体内必定含有另外一条谷胱甘肽合成途径。最近有文献报道，参与脯氨酸生物合成的第一个功能蛋白酶ProB(γ-谷氨酸-5-磷酸激酶)，该酶编码的功能蛋白能以谷氨酸为底物形成γ-谷氨酰焦磷酸，γ-谷氨酰焦磷酸能与半胱氨酸发生亲核反应合成γ-谷氨酰半胱氨酸，即能完成由γ-GCS催化合成的功能反应，再经过GS催化合成谷胱甘肽(VeeravalliK,BoydD,IversonBL,etal.Laboratoryevolutionofglutathionebiosynthesisrevealsnaturalcompensatorypathways.NatureChemicalBiology,2010,7:101-105)。该途径虽可合成GSH，但反应机制不同，称之为谷胱甘肽生物合成的替代途径。谷胱甘肽的主要生产方法有化学合成法、固定化细胞(或酶)法和发酵法。化学合成法生产谷胱甘肽工艺已经成熟，但存在成本高、反应步骤多，需要化学拆分且存在环境污染等问题；酶法生产谷胱甘肽需要获得相关的催化酶系，需要消耗ATP，导致成本高；目前国内外发酵法合成谷胱甘肽的菌种主要是酿酒酵母、产朊假丝酵母等，而生产菌株主要依靠传统的诱变育种方法获得。利用基因工程方法构建谷胱甘肽高产菌株的研究报道较多，主要是将谷胱甘肽标准生物合成途径的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHI)和谷胱甘肽合成酶(GSHII)或双功能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法，包括：i)在宿主菌细胞内转入编码γ‑谷氨酰半胱氨酸合成酶‑连接肽‑谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因，并使其高表达；ii)在宿主菌细胞内转入编码γ‑谷氨酸激酶‑连接肽‑谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因，并使其高表达；iii)敲除宿主菌细胞的γ‑谷氨酰转肽酶基因；iv)敲除宿主菌细胞的肌醇‑3‑磷酸合酶基因；所述i)、ii)、iii)、iv)以任意顺序操作完成后即得所述用于合成谷胱甘肽的基因工程菌；所述i)和ii)中连接肽由6‑34个氨基酸残基组成，其通式为:G‑X‑G‑Y‑G‑Z，其中G为甘氨酸，X、Y、Z分别为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和脯氨酸组成的1～10个氨基酸残基。

【技术特征摘要】
1.一种用于合成谷胱甘肽的基因工程菌的制备方法，包括：i)在宿主菌细胞内转入编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因，并使其高表达；ii)在宿主菌细胞内转入编码γ-谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因，并使其高表达；iii)敲除宿主菌细胞的γ-谷氨酰转肽酶基因；iv)敲除宿主菌细胞的肌醇-3-磷酸合酶基因；所述i)、ii)、iii)、iv)以任意顺序操作完成后即得所述用于合成谷胱甘肽的基因工程菌；所述i)和ii)中连接肽由6-34个氨基酸残基组成，其通式为:G-X-G-Y-G-Z，其中G为甘氨酸，X、Y、Z分别为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和脯氨酸组成的1～10个氨基酸残基；所述i)、ii)、iii)、iv)中的宿主菌为酿酒酵母；所述编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白和γ-谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因由组成型启动子和/或诱导型启动子启动表达，所述组成型启动子为GAP、PGK、ADH1、TEF、CYC1、TPI中任一种，所述诱导型启动子为Gal1、Gal2、Gal3、Gal5、Gal7、Gal10、CUP1、MET25中任一种；所述编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白和γ-谷氨酸激酶-连接肽-谷胱甘肽合成酶融合蛋白的基因通过整合型方式高表达；所述整合型方式高表达通过使用酵母高拷贝的整合位点δ序列实现；所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；所述谷胱甘肽合成酶为SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示的氨基酸序列；所述γ-谷氨酸激酶为SEQIDNO.8或SEQIDNO.10所示的氨基酸序列；所述连接肽为SEQIDNO.12所示的氨基酸序列；所述γ-谷...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟，唐星，唐亮，王玮玮，杨燕，周文龙，朱义波，
申请(专利权)人：唐星，
类型：发明
国别省市：广东;44