本申请公开了一种用于制备抗Lp（a）多克隆抗血清的引物、质粒及该引物和质粒的应用。本申请率先采用克隆表达技术制备了抗Lp（a）多克隆抗血清，并设计了其特异性克隆引物，以及基于该引物的质粒。采用本申请的引物或质粒制备抗原获得的抗Lp（a）多克隆抗血清，与传统的提取纯化人血清制备免疫原方法制备的Lp（a）抗血清相比，抗血清效价高，可达1:256；特异性强，不会与LDL或PLG发生交叉反应；同时，采用本申请的引物或质粒制备抗原获得的抗Lp（a）多克隆抗血清的方法还克服了传统方法的血浆来源困难、社会供给不足的问题；提高了Lp(a)检测的准确性和有效性，为Lp(a)检测的推广应用奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
-种制备抗Lp (a)多克隆抗血清的引物、质粒及应用
本申请涉及抗血清制备领域，特别是涉及一种用于制备抗Lp (a)多克隆抗血清的 引物、质粒，以及该引物和质粒的应用。
技术介绍
血浆脂蛋白按密度分为四大类：乳糜微粒（缩写，CM)、极低密度脂蛋白（缩写， VLDL)、低密度脂蛋白（缩写，LDL)和高密度脂蛋白（缩写，HDL)。同时，在血浆中还存在一 类特殊的脂蛋白：脂蛋白（a)(缩写，Lp(a))，它是一个独立的脂蛋白系统。Lp(a)的脂质成 分与LDL相似，主要由胆固醇脂和甘油三酯组成，表面被覆一层磷脂和游离胆固醇，甘油三 酯的组份大于LDL，Lp(a)与LDL均是胆固醇转移蛋白的底物。Lp(a)含有两类载脂蛋白： ΑροΒΙΟΟ和Apo (a)，前者与LDL的ΑροΒΙΟΟ相同，ΑροΒΙΟΟ上有LDL受体结合位点；后者是 Lp (a)的独特载脂蛋白，ΑροΒ 100和Apo (a)通过1至2个二硫键共价相连。 从Apo (a)的N-末端到C-末端，所有的Kringle域通过两两之间的大约30个氨 基酸的中间序列依次相连。除最靠近C端的Kringle域与纤溶酶原中的Kringle5同源外， 其余Kringle域均与纤溶酶原中的Kringle4同源，并依次被命名为Kringle IV 1?10型； 需要说明的是，人类Apo (a)与人纤维蛋白溶酶原（英文名，Plasminogen.缩写，PLG)在DNA 和蛋白质水平均存在80%的同源性，从而具有共同的抗原决定簇，呈免疫交叉反应。在所有 这10型的Kringle IV中，不同个体的Kringle IV 2型的串联重复数一般在3?43之间变 化，因此Apo (a)的分子量也就在250?838kD的范围中变化，其体积与分子量在相同的个 体内或不同的个体间都具有较大的差异，因其这种特性，决定了 Lp(a)在不同的个体间具 有较大的差异。Kringle IV 9型中有7个半胱氨酸，其中未参与分子内二硫键的第4057位 半胱氨酸（缩写，Cys4057)与载脂蛋白B-100中的第4326位半胱氨酸（缩写，Cys4326)形 成分子间二硫键，进而组成完整的Lp (a)。 Lp(a)是动脉粥样硬化的独立危险因素，是冠心病（CHD)、心肌梗塞（MI)、脑卒中、 动脉重新狭窄的危险因子。另外，Lp (a)水平可作为慢性肾功能衰竭合并心脑血管病及血栓 形成的预示指标。Lp(a)的血清水平受遗传因素的高度影响，个体差异很大，主要由Apo(a) 基因决定，因种族而异，与性别、年龄无关，不易受环境，生活方式和一般降脂药物的干扰， 仅能够被肾衰、急性免疫反应轻微影响。一般把人血清Lp (a)正常值定为<300mg/L。因此， Lp (a)的检测对临床分析和病理分析具有重要的参考价值。 目前，已知的检测Lp (a)浓度的方法有酶联免疫法、放射免疫法、荧光免疫测定法 和免疫比浊法，以上免疫检测方法均需要特异性强的Lp(a)抗血清/抗体作为核心原料。目 前基本上都是采用提纯人血清的方法制备免疫原Lp (a)或Apo (a)，即利用超高速离心机通 过密度梯度离心制取Lp (a)，或者利用SDS-PAGE电泳分离获得Apo (a)抗原；再利用抗原免 疫动物获得抗血清。如前面分析，因为Lp (a)含有两类载脂蛋白：ΑροΒΙΟΟ和Apo (a)，其中 ΑροΒΙΟΟ与LDL的ΑροΒΙΟΟ相同，所以利用Lp (a)作为免疫原制备的抗血清会与LDL存在免 疫交叉反应。而利用Apo (a)作为免疫原，因 Apo (a)的氨基酸结构与PLG很相似，而PLG是 一种以较高浓度存在于人血液中的蛋白质，因此，利用Apo (a)作为免疫原制得的抗血清会 因与PLG发生交叉反应。因此，无论是Lp (a)还是Apo (a)作为抗原制备的抗血清都无法准 确地测定Lp (a)含量。并且，采用提纯人血清的方法制备免疫原Lp (a)或Apo (a)所需血浆 来源困难、社会供给不足；制备的抗血清不仅会与LDL或PLG有交叉反应，特异性较差；而 且，抗血清的效价也不高。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种全新的制备抗Lp (a)多克隆抗血清的引物，基于该引物 的制备抗Lp (a)多克隆抗血清的质粒，以及该引物和质粒的应用。 为了实现以上目的，本申请的一方面公开了一种用于制备抗Lp (a)多克隆抗血清 的引物，该引物包括上游引物和下游引物，上游引物含有Seq ID No. 1所示序列，下游引物含 有所示序列； Seq ID No. 1 :5, -GACATATGAGAAAAGCCCTGTGGTCC-3， Seq ID No. 2 :5, -GACTCGAGCCCACAATCAAATGAAGA-3,。 本申请的另一面还公开了一种用于制备抗Lp (a)多克隆抗血清的质粒，该质粒包 括载体和插入序列；插入序列为本申请的引物以LPA基因为模板进行PCR扩增获得的产物。 优选的，插入序列含有Seq ID No. 3所示序列。 优选的，载体选自但不仅限于pET系列载体和pGEM-T系列载体中的一种。更优选 的，载体为pet28a+。 本申请的另一面公开了本申请的引物在制备抗Lp (a)多克隆抗血清中的应用。 本申请的再一面公开了本申请的质粒在制备抗Lp (a)多克隆抗血清中的应用。 本申请的质粒在制备抗Lp (a)多克隆抗血清中的应用具体包括，将本申请的质粒 转化到原核表达细胞或真核表达细胞中进行融合蛋白表达，然后提取纯化蛋白质，获得抗 原，采用获得的抗原进行动物免疫试验，获得本申请的Lp (a)多克隆抗血清。 优选的，原核表达细胞选自但不仅限于大肠杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌和 链霉菌中的一种，真核表达细胞选自但不仅限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母中的一种。 本申请的实施方式中抗原含有Seq ID No. 4所示序列，优选的，大肠杆菌选自 HB101，BL21，JM109 和 DH5a 中的一种。 由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于： 本申请率先采用克隆表达技术制备了抗Lp (a)多克隆抗血清，采用本申请的引物 或质粒制备抗原获得的抗Lp (a)多克隆抗血清，与传统的提取纯化人血清制备免疫原方 法制备的Lp (a)抗血清相比，抗血清效价高，特异性强，不会与LDL或PLG发生交叉反应； 同时，采用本申请的引物或质粒制备抗原获得的抗Lp (a)多克隆抗血清的方法还克服了 传统方法的血浆来源困难、社会供给不足的问题；提高了 Lp(a)检测的准确性和有效性，为 Lp (a)检测的推广应用奠定了基础。 【附图说明】 图1 :是本申请实施例中克隆片段的PCR扩增结果图，其中Μ为marker，l和2为 PCR扩增产物样品； 图2 :是本申请实施例中收集的融合蛋白的SDS-PAGE检测结果图，其中marker为 蛋白质分子量标，apo (a)为受检样品； 图3 :是本申请实施例中收集的融合蛋白的WESTERN-BLOT分析结果图，其中 marker为蛋白质分子量标，apo (a)为受检样品； 图4 :是本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于制备抗Lp（a）多克隆抗血清的引物，其特征在于：所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物含有Seq ID No.1所示序列，所述下游引物含有所示序列；Seq ID No.1：5’‑GACATATGAGAAAAGCCCTGTGGTCC‑3’Seq ID No.2：5’‑GACTCGAGCCCACAATCAAATGAAGA‑3’。
【技术特征摘要】
1. 一种用于制备抗Lp (a)多克隆抗血清的引物，其特征在于：所述引物包括上游引物 和下游引物，所述上游引物含有Seq ID No. 1所示序列，所述下游引物含有所示序列； Seq ID No. 1 :5' -GACATATGAGAAAAGCCCTGTGGTCC-3' Seq ID No. 2 :5, -GACTCGAGCCCACAATCAAATGAAGA-3,。2. -种用于制备抗Lp (a)多克隆抗血清的质粒，其特征在于：所述质粒包括载体和插 入序列；所述插入序列为权利要求1所述引物以LPA基因为模板进行PCR扩增获得的产物。3. 根据权利要求2所述的质粒，其特征在于：所述插入序列含有Seq ID No. 3所示序列。4. 根据权利要求2所述的质粒，其特征在于：所述载体选自但不仅限于pET系列载体 和pGEM-T系列载体中的一种。5. 根据权利要求4...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢桂华，柴宝玲，
申请(专利权)人：深圳市宝凯仑科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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