L2多表位融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及L2多表位融合蛋白及其应用。具体而言，本发明专利技术涉及包含乳头瘤病毒的L2表位和通用性辅助性T淋巴细胞的串联体和IgG亚型重链基因的改造突变体的融合蛋白、其编码核苷酸、包含所述编码核苷酸的pFastBac1重组质粒、包含所述pFastBac1重组质粒构建的重组Bacmid、包含所述的重组Bacmid的DH10Bac大肠杆菌、由上述组分制备的HPV预防性疫苗及其用途。本发明专利技术可以用于HPV感染及HPV感染相关疾病的免疫预防，具有重要的经济及社会意义。

【技术实现步骤摘要】
L2多表位融合蛋白及其应用
[〇〇〇1] 本专利技术涉及L2多表位融合蛋白及其应用。具体而言，本专利技术涉及包含人乳头瘤病 毒L2抗原蛋白序列和改造抗体的重链蛋白序列的融合蛋白及其应用。
技术介绍
目前已分离鉴定了 100多型人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV)，其中 1/3的为嗜黏膜病毒，其中包括诱发恶性增生的高危型HPV，其感染与宫颈、肛周、阴道、阴 唇、阴茎及口咽癌的发生密切相关，计15种型别，在宫颈癌组织中检出的阳性率由高至底 依次为：HPV16、18、45、31、33、52、58、35、59、56、39、51、73、68、66 ;还包括 12 种诱发尖锐湿 疣等良性病变的低危型（即￥6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、89)、中间型或可疑高危 型（HPV34、57、83)，及尚未确定型（HPV34、57、83)。其余的为嗜皮肤病毒，如HPV5型，主要诱 发皮肤疣状增生。宫颈癌是世界范围第三高发的妇女恶性肿瘤，年发病率约50万，其中亚 洲地区23. 5万；中国的年发病数10万，诱发中国妇女宫颈癌的主要高危型依次为HPV16、 18、58、52、33等。现有上市的HPV病毒样颗粒疫苗仅靶向HPV16及18两种高危型，诱发的 保护反应主要是疫苗涵盖型别特异的，且成本高。因此研发广谱的HPV疫苗意义重大。 L2蛋白是病毒次要外壳蛋白，含有保守的中和抗体表位，诱发产生的抗体常具 有交叉中和活性及免疫保护作用。目前鉴定的HPV16L2保守中和抗体表位有aa. 17-36、 &&.108-120、&3.64-81及33.56-75等，其中33.17-36为免疫优势表位（六1卩]18冊，631]113]1；^& R，Karanam B，et al.Proc Natl Acad Sci USA2008; 105:5850 - 5855.)。但L2合成肽或重组 蛋白免疫诱发产生的中和抗体的滴度很低。目前报道的提高L2表位免疫活性的方法有：1、 构建含改造 TLR2配体及Th表位的呈分支状结构的HPV16L2a. a. 17-36脂肽疫苗，可显著提 高表位的免疫原性；2、将不同乳头瘤病毒来源的22拷贝的aal7-36串联表位直接串联，免 疫效果则很差（Jagu S，Karanam B，Gambhira R，et al.J Natl Cancer Inst. 2009; June2;l 01 (11) :782 - 792.)。提示仅通过增加表位的数目而缺乏有效的呈递方式对疫苗活性的加强 效果并不理想；3、选择具有免疫刺激活性的蛋白为载体，如HPV L1病毒样颗粒（Christina S，Roden R and Kirnbauer R.J. Virol. 2009; 83 (19) :10085.)或细菌硫氧还蛋白（Rubio I，Bolchi A, Moretto N，et al. Vaccine. 2009; 27 (13) :1949-56.)，构建表面展示嵌合L2 表 位的蛋白疫苗，可显著提高L2表位诱导产生中和抗体的能力。通用型Th表位能与大多数 人HLA-DR及小鼠 MHC II分子高亲和力结合，可有效活化Th细胞，促进B细胞更好的完全活 化（Alexander J, del Guercio MF，Maewal A，et al.J Immunol. 2000;164(3):1625_33·)， 常被用在合成肽疫苗中，以提高表位的免疫原性。上述数据提示与具有免疫刺激活性的分 子融合并表面展不融合表位可以强化L2表位的免疫原性。 IgG受体（Fc YR)是专职抗原呈递细胞表面到达的分子，可与免疫复合物或IgG单 体的Fc段结合，促进B细胞活化，显著提高抗原特异性的抗体水平。在四种亚型的Fc γ R 中，以Fc γ RI对IgG单体的亲和力最强，与Fc γ RI的结合区位于IgG绞链区及CH2结构 区（HCH2)。研究发现用四个拷贝HCH2替换IgG重链的VH-CH1段获得的改造重链，经Fc 段介导形成的二聚体与Fc γ R的亲和力显著提高，在其N端融合人血清白蛋白获得的重链 Fc段融合蛋白，免疫后可显著增强血清白蛋白特异性的细胞免疫和体液免疫反应（Jensen ΜΑ, Arnason BG, White DM. Eur.J. Immunol. 2007, 37:1139-1148)。因此，改造后的 IgG 重链 蛋白是极具吸引力的疫苗载体，目前尚未见有将其用于HPV疫苗的报道。由于抗原表位的 呈递效率及融合蛋白的空间结构、生物活性等性质受到其氨基酸一级序列的巨大影响，优 化改造的L2表位与改造抗体融合后是否能被有效呈递，基因工程改造抗体是否人具有免 疫刺激活性，只能依靠具体的实验研究才能确定。因此，改造抗体能否用于HPV L2疫苗以 提高其免疫原性需要具体的探索才能确定。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于获得改造抗体和HPV的L2抗原蛋白融合的融合蛋白，并 研究其在预防HPV感染和HPV感染相关疾病中的用途。 因此，本专利技术的第一方面涉及一种融合蛋白，其包含乳头瘤病毒的抗原蛋白和改 造的抗体蛋白序列，其中乳头瘤病毒的抗原蛋白是人乳头瘤病毒的L2表位和通用性辅助 性T淋巴细胞的串联体且在所述串联体的上游融合有gp67信号肽序列，改造的抗体蛋白选 自所有IgG亚型重链基因的改造突变体，改造抗体是用含四个重复拷贝的铰链区-CH2区的 序列取代IgG重链的VH-CH1区获得，优选地，所述IgG亚型是人的IgGl，优选地，所述串联 体与IgG重链基因的突变体间以GGP连接子相连。 优选地，所述乳头瘤病毒选自高危型HPV和低危型HPV，优选地，高危型HPV选 自 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 及 12 ;更优选地，高危型 HPV 是 HPV16。 优选地，所述串联体是由3个HPV16L2aa. 17-36表位及一个通用型辅助性T淋 巴细胞表位依次串联而获得，L2表位之间以GGP连接子连接，L2表位串与Th表位之间以 Xhol-Kpnl位点及GGP相连，优选地，所述通用型辅助性T淋巴细胞表位的序列如SEQ ID NO :3所示。 最优选地，所述融合蛋白的序列如SEQ ID N0 :2所示。[〇〇1〇] 本专利技术的第二方面涉及上述第一方面所述的融合蛋白的编码核苷酸，优选地，所 述编码核苷酸的序列如SEQ ID N0 :1所示。[〇〇11] 本专利技术的第三方面涉及一种有效连接有上述第二方面所述的编码核苷酸的 pFastBacl重组质粒。 本专利技术的第四方面涉及一种包含利用上述第三方面所述pFastBacl重组质粒构 建的重组Bacmid。 本专利技术的第五方面涉及一种包含上述第四方面所述的重组Bacmid的DHlOBac大 肠杆菌。 本专利技术的第六方面涉及一种利用上述第一方面所述的融合蛋白、第二方面所述的 编码核苷酸、第三方面所述的pFastBacl重组质粒、第四方面所述的重组Bacmid或第五方 面所述的DHlOBac大肠杆菌制备的HPV预防性疫苗。 本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其包含乳头瘤病毒的抗原蛋白和改造的抗体蛋白序列，其中乳头瘤病毒的抗原蛋白是人乳头瘤病毒的L2表位和通用性辅助性T淋巴细胞的串联体且在所述串联体的上游融合有gp67信号肽序列，改造的抗体蛋白选自所有IgG亚型重链基因的改造突变体，改造抗体是用含四个重复拷贝的铰链区‑CH2区的序列取代IgG重链的VH‑CH1区获得，优选地，所述IgG亚型是人的IgG1，优选地，所述串联体与IgG重链基因的突变体间以GGP连接子相连。

【技术特征摘要】
1. 一种融合蛋白，其包含乳头瘤病毒的抗原蛋白和改造的抗体蛋白序列，其中乳头瘤 病毒的抗原蛋白是人乳头瘤病毒的L2表位和通用性辅助性T淋巴细胞的串联体且在所述 串联体的上游融合有gp67信号肽序列，改造的抗体蛋白选自所有IgG亚型重链基因的改造 突变体，改造抗体是用含四个重复拷贝的铰链区-CH2区的序列取代IgG重链的VH-CH1区 获得，优选地，所述IgG亚型是人的IgGl，优选地，所述串联体与IgG重链基因的突变体间以 GGP连接子相连。2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述乳头瘤病毒选自高危型HPV和低 危型 HPV，优选地，高危型 HPV 选自 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 及12 ;更优选地，高危型HPV是HPV16。3. 根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于在所述串联体是由3个 HPV16L2aa. 17-36表位及一个通用型辅助性T淋巴细胞表位依次串联而获得，L2表位之间 以GGP连接子连接，L2表位串与Th表位之间以Xhol-Kpnl位点及GGP相连，优选地，所述 通用型辅助性T...

【专利技术属性】
技术研发人员：许雪梅，陈雪，刘洪洋，张婷，谢喜秀，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11