本发明专利技术属病毒遗传操作领域,具体涉及一种新城疫病毒(NDV)耐热活疫苗载体系统及其应用。本发明专利技术的新城疫病毒耐热活疫苗载体系统包括:a)转录质粒,通过将NDV耐热疫苗株的基因组全长cDNA克隆至pBR322载体中获得;b)三个辅助质粒,分别将NDV耐热疫苗株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白基因克隆至pcDNA3.1载体中获得;c)宿主细胞。本发明专利技术人工获得的重组新城疫病毒具有耐热特性,也是首次建立的具有耐热特性的新城疫病毒活疫苗载体系统。本发明专利技术将在新城疫、禽流感等禽类主要疫病的多联(多价)耐热基因工程活疫苗的研发、病毒耐热机理的研究等方面具有极大的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用
本专利技术属于病毒遗传操作领域,涉及一种活病毒载体系统,更具体地,本专利技术涉及新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用。
技术介绍
新城疫(NewcastleDisease,ND)又称亚洲鸡瘟,是一种由新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)引起的极易传染的毁灭性疾病,有较高的发病死亡率,被国际兽疫局(OIE)列为两种A类禽病之一(另一种为禽流感),属于国家强制性免疫疫病。鸡新城疫自1926年在印尼的爪哇和英国的新城首次暴发以后,一直在除大洋洲以外的全世界范围内流行,给全球造成了巨大的经济损失。在我国,新城疫也是危害最为严重的禽病之一,我国许多地区一直都有该病流行。新城疫的控制以免疫预防为主。近年来随着疫苗的广泛应用,新城疫的大规模暴发流行已受到明显控制,但由于存在疫苗冷链系统不完善、使用方法不当、免疫程序不科学等问题,导致典型和非典型新城疫不断发生。而新城疫宿主范围的不断扩大和变异毒株的出现和流行,都使新城疫的防制工作复杂化。目前,国际上生产和使用的新城疫疫苗有两大类,即活疫苗和灭活疫苗。活疫苗包括低毒力株疫苗和中等毒力株疫苗,低毒力株疫苗包括II系苗(B1)、III系苗(LaSota株)、clone30、V4等;中等毒力疫苗包括I系苗、Roskin株、Komorov株、Hert33株和Mukteswar株等。有些低毒力活疫苗具有独特的耐热特性,称之为耐热活疫苗,代表株有V4、I-2、HB92和TS09-C株等。此类疫苗具有耐热、低毒性、免疫效果好、可同群感染、多途径免疫(拌料、喷雾等)等优点,适用于鸡、鸽、鹌鹑等多种禽类的新城疫防控。与其他非耐热疫苗相比,该疫苗在气温普遍较高的南方地区和冷链条件较差的农村推广应用更有优势,在新城疫的防控中发挥了重要作用。随着分子生物学的飞速发展,NDV的分子基础研究工作取得了较大进展。NDV的基因组RNA通过与其编码的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)一起构成核蛋白复合体,启动RNA的首轮转录及病毒蛋白的翻译合成,病毒的各个组份通过自包装产生具有感染性的子代病毒。根据这一原理,1999年欧洲学者建立了第一个高致病性NDV的反向遗传操作系统。研究表明,NDV基因组可在不同位点插入并表达外源报告基因或免疫源性基因,经细胞或鸡胚连续高代次传代仍保持高度的遗传和表达稳定性。以NDV耐热弱毒株作为活病毒疫苗载体具有极为突出的优点:1)可常温保存运输,降低对冷链系统的依赖,更适宜在气温较高的地区使用;2)有较高的同群感染率,免疫效果更佳确实;3)疫苗毒力极低,对鸡胚不致死,可鸡胚免疫或0日龄免疫;4)复制过程为从RNA到RNA,不存在DNA阶段及与细胞基因组整合的可能性;5)可同时诱导体液免疫、粘膜免疫及细胞免疫,产生更加全面的免疫保护;6)可通过拌料、饮水、喷雾等多种方式给苗,使用方便;7)NDV弱毒具有高滴度的鸡胚生长特性,生长成本低廉。在我国采用NDV弱毒疫苗对新生雏鸡进行免疫是必不可少的,每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百亿羽份以上。因此,NDV耐热弱毒株作为活病毒疫苗载体应用的经济意义十分巨大。从1966年第一株NDV耐热株V4株被分离得到至今,已有多株NDV耐热株被选育、分离得到,如I-2、HB92、TS09-C株等。有些课题组尝试把耐热株改造为耐热载体,但一直未见有成功的研究报道。如:文献“新城疫病毒V4株全基因组测序及全长cDNA克隆的构建”(姜延龙,东北农业大学,博士学位论文,2010年)公开了V4耐热株的转录质粒和辅助质粒的构建,但未能人工拯救出重组的V4耐热株;文献“PlasmidsdrivenminigenomerescuresystemforNewcastlediseasevirusV4strain”(MolBiolRep,2009,36:1909-1914)公开了V4耐热株的微基因组转录质粒和辅助质粒的构建,实现了外源基因在细胞中的表达,但仍未能获得重组耐热病毒。现有关于新城疫活疫苗的文献也较多,但均未见涉及到具有耐热特性的新城疫活疫苗载体的报道。例如:专利号为200510097997.8的文献“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”公开了以新城疫病毒LaSota疫苗株为基础的非耐热活疫苗载体,但未涉及耐热活疫苗载体;专利号为200610075781.6的文献“表达禽流感病毒H5亚型HA蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株”公开了以新城疫LaSota疫苗株载体构建的禽流感、新城疫二联基因工程活疫苗,也未涉及到耐热活疫苗载体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种具有耐热特性的新城疫病毒活疫苗载体系统及其应用。为实现上述专利技术目的,本专利技术的技术方案如下:新城疫病毒耐热活疫苗载体系统,该系统包含:a)转录质粒,所述的转录质粒能够表达新城疫病毒耐热株的基因组全长cDNA序列,通过将新城疫病毒耐热疫苗株的基因组全长cDNA克隆至pBR322载体中获得;b)三个辅助质粒,所述的三个辅助质粒能够分别表达新城疫病毒耐热株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白,通过将新城疫病毒耐热疫苗株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白基因分别克隆至pcDNA3.1载体中获得;c)新城疫病毒耐热株复制许可的宿主细胞。优选BHK-21细胞。按上述方案,所述的新城疫病毒耐热株是耐热疫苗株,为新城疫病毒TS09-C耐热疫苗株。按上述方案,所述宿主细胞为BHK-21细胞。按上述方案,所述转录质粒中的新城疫病毒耐热株的基因组cDNA序列位于T7启动子之后,在编码自我剪切的丁型肝炎核酶序列和T7终止子之前。按上述方案,所述的转录质粒插入并表达有外源基因,所述的外源基因在所述转录质粒中的插入位点在磷蛋白基因和基质蛋白基因之间。按上述方案,所述外源基因包括标记基因或病毒的抗原基因。按上述方案,所述标记基因为绿色荧光蛋白基因。应用上述耐热活疫苗载体系统人工获得重组新城疫病毒耐热株的方法,其特征在于,其包括以下步骤:1)将所述耐热活疫苗载体系统中的转录质粒和辅助质粒共转染新城疫病毒耐热株复制许可的宿主细胞,培养转染后的宿主细胞;2)收获细胞液,过滤后在宿主细胞或SPF鸡胚上进行传代培养,即可人工获得重组新城疫病毒耐热株。按上述方案,所述步骤1)中的转染采用磷酸钙转染法。按上述方案,所述重组新城疫病毒耐热株在56度热处理1小时后,耐热株的血凝素活性无明显下降。TS09-C耐热疫苗株参照中国专利201110163109.3获得。本专利技术的技术原理在于:转录质粒包含有新城疫病毒耐热株的全长基因组序列,三个辅助质粒能够分别表达新城疫病毒耐热株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白。将能够表达T7RNA聚合酶的痘苗病毒预感染宿主细胞,再将转录质粒和三个辅助质粒共转染至该细胞。首先,痘苗病毒能够在宿主细胞内表达T7RNA聚合酶;然后,T7RNA聚合酶识别转录质粒上的T7启动子序列,并启动RNA的复制过程,在T7终止子处终止复制,复制出的RNA序列即为新城疫病毒耐热株的全基因组RNA序列;病毒基因组RNA与三个辅助质粒表达出的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白一起构成核蛋白复合体,启动病毒RNA的首轮转录及病毒蛋白的翻译本文档来自技高网...
【技术保护点】
新城疫病毒耐热活疫苗载体系统,所述系统包含:a) 转录质粒,所述的转录质粒能够表达新城疫病毒耐热株的基因组全长cDNA序列;b) 三个辅助质粒,所述的三个辅助质粒能够分别表达新城疫病毒耐热株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白;及c) 新城疫病毒耐热株复制许可的宿主细胞。
【技术特征摘要】
1.新城疫病毒耐热活疫苗载体系统,所述系统包含:a)转录质粒,所述的转录质粒能够表达新城疫病毒耐热株的基因组全长cDNA序列;b)三个辅助质粒,所述的三个辅助质粒能够分别表达新城疫病毒耐热株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白;及c)新城疫病毒耐热株复制许可的宿主细胞,表达新城疫病毒耐热株的核蛋白的辅助质粒的序列为SEQIDNO:2,转录质粒的全序列为SEQIDNO:1,表达新城疫病毒耐热株的磷蛋白的辅助质粒的序列为SEQIDNO:3,表达新城疫病毒耐热株的大聚合酶蛋白的序列为SEQIDNO:4,所述转录质粒中的新城疫病毒耐热株的基因组cDNA序列位于T7启动子之后,在编码自我剪切的丁型肝炎核酶序列和T7终止子之前。2.根据权利要求1所述的新城疫病毒耐热活疫苗载体系统,其特征在于,所述的新城疫病毒耐热株是耐热疫苗株,为新城疫病毒TS09-C耐热疫苗株。3.根据权利要求1所述的新城疫病毒耐热活疫苗载体系统,其特征在于,所述宿主细胞为BHK-21细胞。4.根据权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员:温国元,邵华斌,杨峻,王红琳,罗青平,张蓉蓉,艾地云,罗玲,商雨,郭静,陈晨,
申请(专利权)人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,
类型:发明
国别省市:湖北;42
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