一种治疗肿瘤的药物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗肿瘤药物及含有这种药物的药物组合物和试剂盒，同时也公开了制备这种抗肿瘤药物的方法。本发明专利技术中的抗肿瘤药物具有体内代谢的稳定性，可用于治疗肿瘤或制备抗肿瘤药物。

【技术实现步骤摘要】
一种治疗肿瘤的药物及其应用本申请是申请日为2007年I月19日，申请号为200780010122.7，专利技术名称为“一种治疗肿瘤的药物及其应用”的中国专利申请的分案申请。
本专利技术涉及一种具有生物活性和代谢稳定性的含有血管内皮抑制素的复合物和缓释制剂以及它的制备方法。本专利技术还提供含有这种血管内皮抑制素复合物和缓释制剂的药物组合物以及含有这种血管内皮抑制素复合物的试剂盒。本专利技术还提供使用本专利技术中的血管内皮抑制素复合物、缓释制剂、药物组合和试剂盒来预防、诊断、治疗肿瘤，及制备抗肿瘤药物的方法。
技术介绍
新生血管形成是指新的毛细血管在原有的血管上的生成。肿瘤的生长和迁移依赖于新生血管的生成，将肿瘤中的微血管内皮细胞作为癌症治疗的靶点为治疗肿瘤提供了一种治疗方式(Folkman J.N Engl J Medl971; 285:1182-1186)。 血管内皮抑制素(Endostatin)是胶原X VDI羧基端的一段分子量大小为20kDa的酶切产物。1997年美国哈佛大学Judah Folkman教授等人在血管内皮瘤细胞的培养基中发现此蛋白，它具有抑制血管内皮细胞增殖、迁移，和体内血管生成的活性。进一步实验发现重组血管内皮抑制素可以抑制老鼠体内多种肿瘤的生长、转移，甚至能完全治愈肿瘤，而且不产生耐药性。其发挥活性的机理在于它通过抑制血管内皮细胞的生长，抑制了肿瘤组织附近的新生血管的生成，使得肿瘤组织得不到生长所必需的大量营养和氧气，最后停止生长或坏死(Folkman J.et al.Cel 11997; 88:277-285; Folkman J.etal.Naturel997;390:404-407)。通过基因工程制备的重组人血管内皮抑制素可以作为肿瘤治疗药物，其临床试验表明它可以有效的抑制肿瘤生长。在中国，以非小细胞肺癌为主要适应症的临床试验表明它对于肿瘤的治疗效果比较突出。 多肽和蛋白质类药物相比于化学药具有毒副作用小，不产生耐药性等优点。为了达到最高的体内活性，提高生物利用度，减少药物体内降解，通常蛋白药物采用静脉给药方式。但是对于分子量小的蛋白来说，通常静脉给药以后的体内半衰期很短。除了体内的蛋白降解过程以外，一个重要的方面是小分子蛋白能够通过肾过滤的途径从体内很快的被消除。在血液中，水力半径超过白蛋白或是分子量大于约66，000道尔顿(66kDa)的蛋白通常可以稳定的保留在循环系统中。但是小分子却会通过肾小球过滤被很快的从血液中消除。所以，为了维持小分子量蛋白在血液中的有效治疗浓度，需要进行频繁的注射或点滴。这种治疗方式虽然能达到治疗的目的，但是却给病人带来了严重的不便与痛苦，提高了用药成本，对某些药物长期的使用还有可能产生一些副作用，例如免疫反应。 作为蛋白药物的血管内皮抑制素同样存在半衰期短，体内清除率高的缺点。目前的临床用药手段主要为频繁的静脉注射或点滴，通常为每天给药，而且需要长期用药，这使得病人的精神和经济负担都比较大。本专利技术的目的就在于改善该蛋白的体内代谢特征，使其具有更高的稳定性和较长的体内半衰期，甚至具有更高疗效，从而达到可以减少用药频率，降低用药成本，减轻病人的经济负担的目的。 用高分子聚合物对蛋白进行修饰，它是改变和控制药物的动力学特性如半衰期、免疫学特征、毒理特性的常用方法。用来修饰蛋白的高分子聚合物具有水溶性好、生物相容性好、无或弱免疫原性等特征。其中聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是应用最为普遍的一种蛋白修饰分子。聚乙二醇分子具有两亲性，既可以溶解于水，又可以溶解于大多数的有机溶剂，具有无毒、无免疫原性、在水溶液中有高溶解性等性质，是被包括美国FDA、中国SFDA在内的很多国家的药品管理机构批准的可用于药物制备的高分子。将蛋白质与亲水性的高分子如聚乙二醇偶联，可增加蛋白稳定性、减少非特异性吸附和抗原性。当偶联物达到一定分子量时，可大大降低肾脏的排除效率，是延长蛋白质药物体内半衰期的有效方法(Frokjaer S.et al.Nat.Rev.Drug Discov.2005Apr4 (4): 298-306;Harris JM.et al.Nat.Rev.Drug Discov.2003Mar2 (3):214-21)。最初的聚乙二醇修饰都是以氨基作为反应位点，主要包括蛋白的N端α -氨基和赖氨酸残基侧链上的ε-氨基。这一类反应的产物是一个蛋白分子与一个或多个PEG分子偶联。对于赖氨酸残基侧链氨基上的修饰也往往因为反应位点不特异而产生修饰后的同分异构体。目前，针对蛋白N端α-氨基和赖氨酸残基侧链氨基的等电点差异，又新开发出了只针对蛋白N端修饰的聚乙二醇修饰试剂，使得修饰位点一致，修饰产物组成均一。另一种可用于聚乙二醇修饰的蛋白位点是半胱氨酸的巯基。由于巯基在蛋白中的数目通常少于氨基，所以这类修饰的位点更加特异。利用基因工程技术，现在可以在蛋白任何部位引入半胱氨酸作为特异的修饰位点。但是此类引入半胱氨酸作为修饰位点也是有一定的局限性，因为对某些本身带有半胱氨酸的蛋白可能会造成二硫键的错配或无法复性。另外蛋白的羧基也是一种常用的修饰位点(Veronese FM et al.Drug Discov.Today.2005Novl; 10 (21): 1451-8.)。聚乙二醇修饰技术已经成功地运用在许多蛋白类药物上，比较成功的包括:PEG-天冬酰胺酶(PEG-asparaginase) (Gra ham ML Adv.Drug Deliv.Rev.55, 1293 - 1302Avramis Vassil1s1.et al.W09939732and US6689762)、PEG-腺酐脱氨酶(PEG-adenosine deaminase) (Levy Yet al.J.Pediatr.113, 312 - 317; Davis S et al.ClinExp.Tmmunol.46:649-652; HershfieldMS et al.N Engl J Med316: 589-596)和 PEG-干扰素(PEG-1nterferon a 2a、PEG-1nterferon a 2b 等)(Bailon P et al.C.B1conjug.Chem.12, 195 - 202, Wang YS etal.Adv.Drug Deliv.Rev.54, 547 - 570,Meng Xiantai et al.W02005077421, Van VlasselaerPeter et al.W02004076474, Ballon Pascal Sebastian et al.US2004030101, KarasiewiczRobert et al.EP0593868)等等。 其他代表性的高分子修饰剂有葡聚糖、聚蔗糖、淀粉、聚丙氨酸、乙二酸和丙二酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚1，3_乙二醇次甲基醚、乙烯和顺丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、环糊精等。 将血液蛋白或其片段作为载体，与药用蛋白偶联或融合表达，从而起到增加蛋白分子量的目的，是另一种延长药用半衰期的方法。例如用免疫球蛋白的Fe片段和目的蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个血管内皮抑制素分子与一个聚乙二醇分子偶联形成的复合物，其中聚乙二醇分子通过血管内皮抑制素N端的α‑氨基或附加的半胱氨酸残基上的巯基与血管内皮抑制素偶联，所述的聚乙二醇的平均分子量为1kDa至100kDa，优选为5‑40kDa。

【技术特征摘要】
2006.01.20 CN 200610011247.91.一个血管内皮抑制素分子与一个聚乙二醇分子偶联形成的复合物，其中聚乙二醇分子通过血管内皮抑制素N端的α-氨基或附加的半胱氨酸残基上的巯基与血管内皮抑制素偶联，所述的聚乙二醇的平均分子量为IkDa至10kDa,优选为5_40kDa。2.权利要求1的复合物，其中聚乙二醇分子的平均分子量为20kDa或40kDa。3.权利要求2的复合物，所述聚乙二醇为平均分子量是20kDa的线性单甲基聚乙二醇。4.权利要求2的复合物，所述聚乙二醇为平均分子量是40kDa的分叉聚乙二醇。5.权利要求1的复合物，其中所述附加的半胱氨酸残基是连接于血管内皮抑制素分子内部或其N末端或C末端的半胱氨酸残基，或是位于连接于血管内皮抑制素分子内部或其N末端或C末端的含有半胱氨酸的肽链上的半胱氨酸残基。6.权利要求1-5中任一项的复合物，其中血管内皮抑制素是哺乳动物来源的，特别是人或鼠来源的。7.权利要求6的复合物，其中血管内皮抑制素具有SEQID N0.1或者SEQ ID N0.2所示的序列。8.权利要求6的复合物，其中血管内皮抑制素是血管内皮抑制素的具有生物学活性的片段、突变体、衍生物、异构体或是它们的组合。9.权利要求8的复合物，其中血管内皮抑制素片段具有SEQID N0.3、SEQ ID N0.4、或SEQ ID N0.5 的序列 。10.权利要求8的复合物，其中血管内皮抑制素衍生物是在SEQID N0.1的N端或C端附加一段长度为1-15个氨基酸的肽链形成的。11.权利要求10的复合物，其中血管内皮抑制素衍生物具有SEQID N0.6或者SEQ IDN0.7的序列ο12.权利要求1-11中任一项的复合物和生物学相容的物质形成的缓释制剂，所述的缓释制剂的形式选自微胶囊、水凝胶、微球、微型渗透泵或脂质体。13.—种药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项的复合物或权利要求12的缓释制剂、以及药学上可接受的载...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗永章，韩庆，雷清新，常国栋，付彦，
申请(专利权)人：清华大学，北京普罗吉生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11