进行定量测定的方法技术

本发明专利技术涉及用于确定分析物分子或粒子的浓度估值E(C)的方法，其中将预定体积的样品分至一定数目的(N)隔室，所述(N)隔室包含不同样品体积(vi)和/或不同稀释因数(di)的样品或由其组成，在所述(N)隔室的任一个中存在的至少部分分子或粒子提供可测量的信号并且所述分子或粒子的估计浓度E(C)为所测量信号的函数，以及涉及用于本发明专利技术的方法的装置，本发明专利技术方法的应用，在用于本发明专利技术方法样品架和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】进行定量测定的方法
本专利技术涉及用于确定粒子的浓度估值E(C)的方法，其中将预定体积的样品分至一定数目的(N)隔室，所述(N)隔室包含不同样品体积(vi)和/或不同稀释因数(di)的样品或由其组成，在所述(N)隔室的任一个中存在的至少部分粒子提供可测量的信号并且粒子的估计浓度E(C)为所测量信号的函数，以及在本专利技术的方法中使用的装置，本专利技术方法的应用，在本专利技术的方法中使用的样品架和试剂盒。
技术介绍
在分析化学中，定量分析物粒子浓度的标准(或“类似的”)方法为：校准其如何关联物理量的可测量振幅，例如光穿过样品的吸收度。然后将所述分析物粒子的浓度估值E(C)恢复为所述信号的函数。聚合酶链反应(PCR)构成用于定量核酸浓度的现有技术的一种方法。PCR程序一般允许复制DNA链的片段。代表性地，所复制的片段长度不超过10k碱基对(bp)，并且在定量PCR中，通常复制较短的片段。根据现有技术的方法，所复制的DNA副本例如用仅在与双链DNA形成复合物(染料-DNA复合物)后显示强荧光的荧光染料(例如SYBRGreen或EvaGreen.[Advan.Physiol.Educ.29:151-159,2005])进行标记以提供可测量的信号(荧光水平)。所述荧光水平随着DNA片段的增加成比例地增加。当靶DNA片段存在于样品中时，它们的数目在所述PCR过程期间增加得非常快，作为已完成循环数的函数几何级地增加。副本数目的快速增加在制备应用中以及在旨在检测靶DNA存在的定性诊断测定(例如，作为特定微生物在样品中存在的证据)中是吸引人的。同时，靶DNA的复制的指数增长(作为循环数的函数)大大妨碍了进行PCR过程前的样品中的靶DNA副本的初始数的测定。根据现有技术，所谓的real-timePCR提供了方法，其中在每个PCR循环后检测样品的荧光活性(即，信号强度)，随后通过比较作为时间函数的样品的荧光强度与校准曲线来估计样品中的初始DNA浓度。这些程序的准确性是有限的。它们的额外的缺点为对于每个定量必须进行额外的比较(参照)实验。在1999年，Vogelstein和Kinzler提出一种使用观察者的能力检测二元随机函数k(C)的数字测定，当已检查的体积发生于包含至少一种分析物粒子时采取正值(k＝1)或者否则采取负值(k＝0)。根据“正”隔室的部分(即，产生k＝1的那个)估计浓度。由于所述测定需要存在的分析物粒子的强扩增，所以它们的关键应用通常在定量PCR或酶联免疫吸附测定(ELISA)中。根据现有技术的数字PCR方法，将总体积V的PCR混合物(样品和试剂)分至等体积(v＝V/N)的N个隔室。然后，在全部隔室中(优选同时)进行PCR反应循环，例如通过温度的周期性变化。随后，在每个隔室分别完成PCR过程后(终点测量)测量代表性地荧光强度，并且对于其中完成反应的隔室的数目，计数产生“正”信号的隔室并且正隔室数K连同N用于计算所测试样品中的靶DNA副本的实际初始数目M的估值E(M)。数次测定概念的发展在分析化学中提供了新范式。它允许绝对定量而无需实验装置(set-up)的校准。并且，它得益于简化的实验室程序，即终点测量，以及解释实验结果所需要的相对简单的数学工具。然而，现有技术的数字测定是受限制的。1.在测定中，有待确定的分析物粒子的最大数目M与隔室的数目N成正比。在许多应用中以及诊断性定量测定的潜在应用中，动态范围的跨度(Ω＝C+/C-)(C+代表测定中的分析物粒子的估计浓度的上限以及C-代表下限)较大，例如等于1百万或更多。为了达到标准数字PCR程序中的这样大跨度的动态范围，根据不利地忽略了在非常小浓度的小的精确度的本领域的知识状态所述样品必须被分至适当大量的隔室(在所述实施例中)，分至多达200,000个隔室或者实际上如下文中的描述所示，甚至600,000个隔室中。但是将样品分至这样巨大数目的隔室中可能是不利的，因为这样的测定需要执行专业的、复杂的和昂贵的设备。尤其是，旨在分配、扩增和检查好几万或数十万或数百万的隔室的测定的设计需要从许多小体积的微加工、自动化以及快速和感光检测的昂贵技术。此外，通过现有技术的数字测定所实现的精确度和动态范围不能独立地调整(tuned)，缩小了应用的范围并提高了测定的技术成本。因此，当使用现有技术的数字测定使用少数N的隔室时，在缩小范围的浓度获得高的精确度(低标准偏差)是不可能的。现有技术提高了增加测定的动态范围跨度的解决方法以及通过将传统的数字定量测定与不同的动态范围结合而减少隔室的数目[Shen,F.；Sun,B.；Kreutz,J.E.；Davydova,E.K.；Du,W.；ReddyP.L.；Joseph,L.J.；Ismagilov,R.F.,“MultiplexedQuantificationofNucleicAcidswithLargeDynamicRangeUsingMultivolumeDigitalRT-PCRonaRotationalSlipChipTestedwithHIVandHepatitisCViralLoad”,J.Am.Chem.Soc.,ArticleASAP(X2011)]。所述解决方法依赖同时进行对多组隔室的测定。属于每组的隔室具有相同的体积。在引用的实例中，使用Nz＝4组，每组Nj＝160个隔室(j＝1至4)，四组的每组中的隔室体积等于Vj＝1、5、25和125nL。所述程序在于i)将所述样品分至组和隔室中，ii)同时进行信号扩增，iii)在Nz组的每组中分别计数正信号的数目Kj以及iv)计算样品中的粒子的最可能的初始浓度。所述计算是费劲的和要求高的，因为反复计算乘积(product)的需求其中乘法算子表示对于Nz隔室家族的每个所计算的Nz项的乘积，每个项包括观察来自j-th家族的Kj正信号的可能性。结果的计算需要所测试的每个的所述乘积，在测试动态范围内的C的假设值的迭代计算，直到找到对于其上述乘积假定最大值的值C。在来自样品的信号的每个测量后必须重复上述程序，其干扰了测试结果的分析，需要足够快的电子设备(device)或者延长获得样品中的粒子数目的估值所需要的时间。上述程序在通过所述隔室在一个组内具有相同的体积，但是对于每两个不同的组具有不同体积表征的大数目(例如，十个，或数十个，或百个或更多)组的隔室的情况下将特别肯定不利。此外，WO2012/100198A2公开了用不同的体积进行数字测量并因此拓宽了动态范围的方法。尽管前述数字测定提供了动态范围的增加，然而所述分析是非常费劲的并且隔室的数目依然比较高。因此，提供更容易被分析和允许使用较小数目的隔室以降低对于制备样品架，对于分配样品、扩增和检测的程序，对于实现这些任务的装置以及对于测定结果的分析的技术需求的方法将是可取的。因此，存在提供用于确定粒子浓度估值E(C)的需要，其中期望的动态范围和期望的测定精确度可被独立地调整，和/或数学分析更容易，和/或其中对于预定的动态范围和预定的标准偏差a)可调整，优选地减少包含预定样品体积的隔室的总数目(N)和/或b)可调整，优选地减少全部(N)隔室中的包含样品、适合于将至少部分粒子扩增至可测量信号的一种或多种试剂和任选的一种或多种稀释剂或由其组成的混合本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于确定粒子浓度估值E(C)的方法，其中将预定体积的样品分至一定数目的(N)隔室中，在所述(N)隔室的任一个中存在的至少部分粒子提供可测量的信号并且所述粒子的估计浓度E(C)为所测量信号的函数，其特征在于，所述方法包括以下或由其组成：a)确定分离的隔室的数目(N)，其中所述数目(N)小于或等于以下函数的值NMAX=A·1n(C+C-)/σMAX2]]>其中(A)表示为整数6的实数，其中(C+)表示要以所述方法估计的浓度(C)的区间的预定上限，其中(C‑)表示要以所述方法估计的浓度(C)的区间的预定下限，其中(σMAX)表示粒子浓度估值E(C)的预定的最大可允许的相对标准偏差，其中C‑<C<C+，以及b)确定调制因数(zi)，其中(zi)为所述(N)隔室的至少部分或全部中的样品的体积(vi)和稀释因数(di)的函数；并将所述样品分至(N)隔室，其中两个或更多个所述(N)隔室的至少部分或全部包含不同样品体积(vi)和/或不同稀释因数(di)的样品或由其组成，其中(i)表示由整数0至N‑1表示的所述(N)隔室的索引号，并且其中(vi)表示所述体积以及(di)表示所述隔室(i)中的样品的稀释因数。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.17 PL 397028;2011.11.17 PL 397027;2011.11.1.用于确定粒子浓度估值E(C)的方法，其中将预定体积的样品分至一定数目的(N)隔室中，在所述(N)隔室的任一个中存在的至少部分粒子提供可测量的信号并且所述粒子的估计浓度E(C)为所测量信号的函数，其特征在于，所述方法包括以下：a)确定分离的隔室的数目(N)，其中所述数目(N)小于或等于以下函数的值其中(A)表示为整数6的实数，其中(C+)表示要以所述方法估计的浓度(C)的区间的预定上限，其中(C-)表示要以所述方法估计的浓度(C)的区间的预定下限，其中(σMAX)表示粒子浓度估值E(C)的预定的最大可允许的相对标准偏差，其中C-<C<C+，以及b)确定调制因数(zi)，其中(zi)为所述(N)隔室的至少部分中的样品的体积(vi)和稀释因数(di)的函数；并将所述样品分至(N)隔室，其中两个或更多个所述(N)隔室的至少部分包含不同样品体积(vi)和/或不同稀释因数(di)的样品，其中(i)表示由整数0至N-1表示的所述(N)隔室的索引号，并且其中(vi)表示所述体积以及(di)表示所述隔室(i)中的样品的稀释因数；c)任选地用一种或多种合适的试剂和任选的一种或多种稀释剂扩增隔室的粒子以获得指示隔室中预定临界数目的粒子的存在的可测量信号，d)测量所述(N)隔室的每一个中的所述信号并对至少部分隔室指定值(ki)，其中(i)表示由整数0至N-1表示的隔室的索引号并且如果隔室(i)包含预定临界数目的粒子或更多粒子，就对隔室(i)指定第一值(ki)，如果隔室(i)包含少于指示第一值的临界数目的粒子，就对隔室(i)指定第二值(ki)，以及e)确定粒子的估计浓度E(C)，其中粒子的估计浓度E(C)通过以下函数确定：i.第一和/或第二值(ki)的加和K，和/或ii.加权的第一和/或第二值(wiki)的加和K，其中所述值(ki)的至少一部分用权重值(wi)进行调制，其中(i)表示由整数0至N-1表示的所述隔室的索引号，和/或iii.微态μ的编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它清楚的表示，其中所述编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它表示包含表示微态μ的反映步骤e)中测量的值(ki)的至少一部分的信息。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述调制因数(zi)通过函数zi＝(vidi)/(v0d0)或其类似函数确定，其中所述类似函数表达关于隔室中粒子估计数目的逐对差异的信息，其中(i)、(vi)和(di)如权利要求1中所定义的并且其中(v0)表示参照隔室中的样品的体积以及(d0)表示参照隔室中的样品的稀释因数，其中所述参照隔室与隔室(i)不同。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述参照隔室表示(N)隔室系列中的第一隔室。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中1％所述(N)隔室在调制因数(zi)的值上彼此不同。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中5％的所述(N)隔室在调制因数(zi)的值上彼此不同。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中25％的所述(N)隔室在调制因数(zi)的值上彼此不同。7.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中50％的所述(N)隔室在调制因数(zi)的值上彼此不同。8.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中75％的所述(N)隔室在调制因数(zi)的值上彼此不同。9.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中100％的所述(N)隔室在调制因数(zi)的值上彼此不同。10.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中在步骤b)中调制因数(zi)的值基于良好定义的幂序列，指数序列，多项式序列或者等比序列或者基于预先确定的在隔室组中的分布，或者它们的组合。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述预先确定的在隔室组中的分布通过高斯分布确定。12.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b)中将所述样品以这样的体积(vi)和稀释因数(di)分配至(N)隔室以满足以下条件：(vi+1di+1)/(vidi)＝zi+1/zi＝x其中x>0且x≠1，将隔室的数目(N)设置为不小于由以下函数确定的值的整数：其中(ΔN)为不小于由以下函数确定的值的整数：ΔN＝4.5637(1-x)-0.798并且其中dovo的值由以下函数确定：其中(C+)，(C-)，(do)和(vo)如权利要求1和2中所定义的。13.根据权利要求11所述的方法，其中(x)的值由0.1,0.5,0.8,0.9,0.91,0.92,0.93,0.94,0.95,0.96,0.97,0.98,0.99,1.01,1.02,1.03,1.04,1.05,1.06,1.07,1.08,1.09,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,2或10表示。14.根据权利要求12所述的方法，其中系数x＝(vi+1di+1)/(vidi)通过以下函数确定：其中(σMAX)如权利要求1和2中所定义的。15.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中在步骤b)中将所述样品以这样的体积(vi)和稀释因数(di)分配至(N)隔室以满足以下条件：其中(A)和(B)表示相互独立的任意实数，其中(C+)，(C-)和(σMAX)如权利要求1中所定义的。16.根据权利要求15所述的方法，其中A＝1/C+和/或B＝[1.95·ln{(C+/C-)/N}]0.856，其中(C+)，(C-)如权利要求1中所定义的。17.根据权利要求15所述的方法，其中将所述样品分至(N)隔室其中(C+)，(C-)和(σMAX)如权利要求1中所定义的。18.根据权利要求15所述的方法，其中将所述样品分至(N)隔室其中(C+)，(C-)和(σMAX)如权利要求1中所定义的。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述预定临界数目的粒子为一个、两个、三个或更多。20.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少部分为全部。21.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和/或第二值(ki)的加和K使用校准修正函数进行修正。22.根据权利要求1所述的方法，其中所述值(ki)的至少一部分用权重值(wi)进行调制是每个值(ki)用权重值(wi)进行调制。23.根据权利要求22所述的方法，其中权重值(wi)与编号(i)的隔室的体积和/或稀释的程度成反比。24.根据权利要求1所述的方法，其中所述加权的第一和/或第二值(wiki)的加和K使用校准修正函数进行修正。25.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含表示微态μ的反映步骤e)中测量的值(ki)的至少一部分的信息是包含矢量k≡{ki},，其中所述矢量(k)包含步骤e)中测量的值(ki)的至少一部分。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一部分是全部。27.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中在步骤b)中将所述样品分配至若干一定数目的(NLIB)两个或更多分离组的隔室(库)，每个库组用(j)进行索引编号并含有Nj’>0个隔室，相同库中的每个隔室包含具有相同调制因数(zj)值的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·加尔斯特茨基，帕维乌·拉法乌·登布斯基，米哈乌·奥斯曼尼克，托马什·卡明斯基，亚当·瓦尔霍乌斯基，
申请(专利权)人：好奇诊断有限责任公司，
类型：发明
国别省市：波兰;PL