一种用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法，其包括：设计并合成一段多肽序列，将其牢固修饰于工作电极表面，并通过占位分子使其有序排列，通过该多肽特异性识别待检测溶液中凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸的性质，将凋亡细胞固定于电极表面。由于电极表面覆盖了一层凋亡细胞，工作电极的电化学响应会发生相应改变，通过对比检测前后，其电化学信号变化的程度，可检测待测样品中细胞凋亡的程度。这种方法避免使用抗原抗体的特异性结合，可以有效降低检测成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及电化学检测
，特别涉及一种基于多肽识别体系的细胞凋亡电化学检测方法。
技术介绍
细胞死亡根据发生机制、诱因、死亡范围、形态特征、生化特征等可分为坏死和凋亡。凋亡是细胞程序性死亡的表现形式，由体内外因素诱导细胞内预存的死亡程序，从而导致细胞主动性死亡，在形态和生化特征上都有别于坏死，该过程是由基因控制的细胞自主的有序的死亡，不会引起机体的炎症反应，能够维持人体内环境的稳定，对整个生物个体正常生长发育、免疫系统调节、机体清除受损或衰老细胞起着非常重要的作用。已证实肿瘤发生的相关因素如细胞增殖和死亡的失衡、异常血管形成、肿瘤的转移扩散均与细胞凋亡的异常有关。对细胞凋亡的分子机制研究和精确检测能有助于阐明多种疾病的发病机理并为这些疾病治疗探索新的方法。目前已开发出多种细胞凋亡的检测方法，按照方法学可将其分为形态学、生物化学、免疫化学和分子生物学测定法。流式细胞分析是目前用于细胞凋亡分析和检测较多的方法，它具有以下优点：(1)快速灵敏；(2)重复性好，结果准确；(3)可对活体细胞进行分析，结果真实；(4)可定量检测凋亡细胞数等。然而该方法依赖于大型仪器，且所用试剂十分昂贵，因此仍需开发一些操作方便，成本低廉的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于多肽识别体系的细胞凋亡电化学检测方法，其根据修饰于工作电极的特定序列多肽，将凋亡细胞固定于电极表面，改变工作电极的环境，根据电化学响应的变化，定性得出待测溶液中细胞的凋亡程度。本专利技术提供一种用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法，将修饰有多肽序列的工作电极插入到待测溶液中，当待测溶液中有凋亡细胞时，凋亡细胞表面外翻的磷酯酰丝氨酸与多肽序列发生反应，从而使凋亡细胞固定于工作电极上的多肽序列表面，检测工作电极的电化学响应值，并与未固定有凋亡细胞但修饰有多肽序列的工作电极的电化学响应值比较，从而确定待测溶液中细胞的凋亡程度；所述多肽序列至少包含由人工合成的序列片段“FNFRLKAGAKIRFG”。优选的是，所述的用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法，所述多肽序列为FNFRLKAGAKIRFGRGC。优选的是，所述的用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法，所述多肽序列由固相合成法或液相合成法合成。优选的是，所述的用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法，工作电极在修饰有多肽序列后、插入待测溶液前加入占位分子，以辅助多肽序列在工作电极表面的有序排布。优选的是，所述的用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法，所述工作电极为金电极或碳电极。优选的是，所述的用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法，所述电化学响应通过循环伏安法或差分脉冲伏安法或交流阻抗法测得。本专利技术的有益效果是：将多肽-凋亡细胞识别体系与电化学技术有机结合，用于细胞凋亡的定性检测，它不仅克服了对流式细胞仪等昂贵仪器的依赖，还避免了抗原抗体等昂贵试剂的使用，极大地降低了检测成本，有助于相关疾病的早期诊断。附图说明图1为本专利技术所述的用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法的流程图。图2为本专利技术所述的电化学检测方法中交流阻抗法所得表征数据图谱，其中，(a)裸电极、(b)多肽修饰电极、(c)浸泡正常细胞后的多肽修饰电极、(d)浸泡凋亡细胞后的多肽修饰电极。图3为本专利技术所述的电化学检测方法中的循环伏安图，其中，(a)裸电极、(b)多肽修饰电极、(c)浸泡正常细胞后的多肽修饰电极、(d)浸泡凋亡细胞后的多肽修饰电极。图4为本专利技术所述的电化学方法检测不同浓度的双氧水诱导细胞凋亡的差分脉冲伏安图，从上到下浓度依次为0、25、50、80、100μM。图5为本专利技术所述的电化学方法检测不同浓度的双氧水诱导细胞凋亡的差分脉冲伏安曲线峰电流与双氧水浓度的线性关系图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本专利技术提供一种用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法，包括以下步骤：步骤1)将多肽序列修饰在工作电极表面，检测其电化学响应，得到第一响应值；步骤2)将工作电极浸泡入待测溶液中，当待测溶液中含有凋亡细胞时，利用多肽序列特异性识别凋亡细胞表面外翻的磷酯酰丝氨酸的性质，将凋亡细胞固定于工作电极上的多肽序列表面，并检测此时工作电极的电化学响应，得到第二响应值；步骤3)通过比较第一响应值和第二响应值来确定待测溶液中细胞的凋亡程度。请参见图1，其更清晰地表示出了本案的总流程图，图中多肽序列为FNFRLKAGAKIRFGRGC，下划线部分为“核心序列”片段，它可以与凋亡细胞外翻的磷酯酰丝氨酸特异性结合，“RGC”片段为“改性序列”，它的作用是通过增加多肽长度，来使得固定于电极表面的“核心序列”和凋亡细胞在相互作用时不会受到影响。“RGC”片段中C端的半胱氨酸提供巯基基团，可以与工作电极如金电极发生共价反应，从而连接到工作电极。多肽序列由人工设计并合成，可通过固相合成法或液相合成法来合成获得。上述步骤2)中的工作电极在修饰有多肽序列后、插入待测溶液前应加入占位分子，占位分子本身具有一定的长度，它是通过小分子的空间位阻效应来辅助多肽序列在工作电极表面的有序排布。工作电极可优选为金电极或碳电极。电化学响应可以通过循环伏安法或差分脉冲伏安法或交流阻抗法测得。实施例本实施例中使用的占位分子为巯基己醇，使用的细胞为MCF-7，使用的工作电极为金电极。1.1、多肽修饰电极的制备a、打磨金电极，步骤包括砂纸研磨，不同颗粒大小的三氧化二铝浆研磨，乙醇/水超声，50％硝酸浸泡，0.5M硫酸电化学清洗等。b、金电极浸泡入0.1mM多肽溶液中，反应过夜，然后去离子水清洗电极。c、接着将电极浸泡0.1mM巯基己醇，反应30min，再用去离子水清洗电极。1.2、培养细胞MCF-7细胞使用DMEM培养基(10％血清)培养，温度为37℃，二氧化碳浓度为5％，细胞培养到指数期时，将细胞消化，清洗以待用。1.3、电极表面多肽与凋亡细胞相互作用将多肽修饰电极浸泡入待测细胞溶液中，孵育1小时，然后清洗干净，并将其作为工作电极。使用铂丝电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，构建三电极系统。凋亡程度高的细胞溶液中有更多凋亡细胞结合到电极表面，阻碍电子传递，通过使用交流阻抗、循环伏安或差分脉冲伏安法检测工作电极的电化学本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法，其特征在于，将修饰有多肽序列的工作电极插入到待测溶液中，当待测溶液中有凋亡细胞时，凋亡细胞表面外翻的磷酯酰丝氨酸与多肽序列发生反应，从而使凋亡细胞固定于工作电极上的多肽序列表面，检测工作电极的电化学响应值，并与未固定有凋亡细胞但修饰有多肽序列的工作电极的电化学响应值比较，从而确定待测溶液中细胞的凋亡程度；所述多肽序列至少包含由人工合成的序列片段“FNFRLKAGAKIRFG”。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法，其特征在于，将修饰
有多肽序列的工作电极插入到待测溶液中，当待测溶液中有凋亡细胞时，凋
亡细胞表面外翻的磷酯酰丝氨酸与多肽序列发生反应，从而使凋亡细胞固定
于工作电极上的多肽序列表面，检测工作电极的电化学响应值，并与未固定
有凋亡细胞但修饰有多肽序列的工作电极的电化学响应值比较，从而确定待
测溶液中细胞的凋亡程度；所述多肽序列至少包含由人工合成的序列片段
“FNFRLKAGAKIRFG”。
2.根据权利要求1所述的用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法，其
特征在于，所述多肽序列为FNFRLKAGAKIRFGRGC。...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪鹏，王弼陡，殷建，韩坤，唐玉国，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32