一种制备艾卡拉肽的方法技术

本发明专利技术涉及制备艾卡拉肽的固相-液相全合成方法，所述方法收率高且后处理方便，为艾卡拉肽的工业规模生产提供了一种新的思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备多肽的方法，具体涉及一种制备Ecallantide（艾卡拉肽）的方法。
技术介绍
Ecallantide（后文称为“艾卡拉肽”）为一种长链多肽，其由60个氨基酸顺序构成，并含有三对二硫键。艾卡拉肽的序列如SEQ ID NO.：1所示:美国食品药品监督管理局于2009年12月1日批准Oyax公司新药艾卡拉肽（商品名：Kalbitor）用于遗传性血管水肿（HAE）突发或致命性积液的治疗。艾卡拉肽是在美国上市的第二种治疗HAE发作的药物。该药为皮下注射剂，适用于16岁及16岁以上有HAE发作史的患者但是，在2012年6月14日，Dyax公司发布了艾卡拉肽用于治疗血管紧张素转化酶（ACE）抑制物所致血管神经性水肿II期临床试验的中期分析结果。基于其中期结果不是非常理想，Dyax公司决定中断此药的临床研究，转向基于艾卡拉肽的进一步深度研究和开发。虽然，艾卡拉肽在随机、双盲、安慰剂对照的II期临床试验中表现没有预期的良好，但是其为治疗遗传性血管水肿提供了一个有前景的方向，可以预见，以后在艾卡拉肽的基础上将会衍生出许多新的药品用于治疗遗传性血管水肿，因此，需要建立一种制备艾卡拉肽的方法以满足不断增加的科研需要。由于艾卡拉肽的肽序较长并且其中含有三对二硫键，在合成过程中肽链容易发生卷曲，反应位点不易裸露，故鲜有化学合成的方法报道。目前，艾卡拉肽相关的专利主要集中于药理活性和治疗方面，例如WO2007/106746A2、US2007/0213275A1和EP20070758271中记载的。迄今为止，尚没有对艾卡拉肽进行化学全合成的报道。
技术实现思路
现有技术的固相多肽合成中，常规的逐个偶联方法在进行长肽的偶联时，往往随着偶联氨基酸的个数增多而易使肽链发生折叠卷曲，反应位点裸露不足，导致偶联效果越来越差。此外，由于艾卡拉肽的肽链中包含三对二硫键，常规方法由于采用了多对二硫键逐对的进行定向氧化方法，使用了多种侧链脱除和氧化试剂，每一个步骤必然带来杂质的增多，因此不利于得到高纯度，高收率的产物，也不利于工艺的放大。针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种艾卡拉肽的全合成方法，具体提供一种艾卡拉肽的固相-液相全合成方法，其包括下述步骤：（1）以2-CTC树脂为载体分别合成以下肽树脂：1、Fmoc-Gly-CTC树脂；2、Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂；3、Fmoc-Pro-CTC树脂；4、Fmoc-Ala-CTC树脂；然后采用固相多肽合成方法分别将肽树脂1、2、3、1和4从C端到N端逐一偶联上带有Fmoc保护基的氨基酸，再经裂解液裂解得到相应的多肽片断A、B、C、D和E，其中多肽片段A为Fmoc-Gln(Trt)-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Tyr(tBu)-Gly-OH；多肽片段B为Fmoc-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Phe-Phe-Asn(Trt)-Ile-Phe-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-OH；多肽片段C为Fmoc-Pro-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Ala-Ala-His(Trt)-Pro-OH；多肽片段D为Fmoc-Phe-Lys(Boc)-Ala-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Gly-OH；多肽片段E为Fmoc-Glu(OtBu)-Ala-Met-His(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Cys(Acm)-Ala-OH；（2）以王树脂为载体合成Fmoc-Asp(OtBu)-王树脂，然后采用固相多肽合成方法将其从C端到N端逐一偶联上带有Fmoc保护基的氨基酸，得到肽树脂F，其中带Fmoc保护基的氨基酸依次为Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH和Fmoc-Gly-OH；（3）将步骤（1）中带保护基的多肽片断按照A、B、C、D和E的顺序依次与肽树脂F以固相多肽合成方法偶联得到艾卡拉肽线性肽树脂；（4）对步骤（3）中的艾卡拉肽线性肽树脂进行裂解，得到包含六个-Cys(Acm)-片段的艾卡拉肽线性肽；（5）脱除步骤（4）的产物中-Cys(Acm)-片段上的Acm保护基，得到艾卡拉肽线性肽；（6）采用合适的氧化体系将步骤（5）的艾卡拉肽线性肽的三对二硫键环化，得到艾卡拉肽。本专利技术制备艾卡拉肽的固相-液相全合成方法是迄今艾卡拉肽的唯一的化学全合成方法，其操作简单、反应条件温和、后处理容易、原料易得，为艾卡拉肽的大规模生产提供了一种全新的思路。附图说明图1为本专利技术艾卡拉肽制备方法的合成路线图。图2为艾卡拉肽粗肽经过RP-HPLC纯化的色谱图，在该谱图中，保留时间t=14.108分钟处为艾卡拉肽的信号峰，峰面积为99.13%。具体实施方式术语解释本文通篇的术语“固相多肽合成方法”是指多肽合成领域已知的Fmoc固相合成方法，例如记载于Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,W.C.Chan,Peter D.White著，March2,2000（ISBN-10:0199637245）,英国Oxford University Press。本文通篇的术语“肽树脂”是指多肽的C端连有树脂、N端的氨基连有Fmoc保护基的多肽树脂。本文通篇的术语“多肽片段”是指上文提及的“肽树脂”脱除C端树脂露出游离羧基、N端的氨基连有Fmoc保护基的多肽。本文通篇的术语“艾卡拉肽线性肽”是指上文提及的“肽树脂”脱除C端树脂露出游离羧基并且其分子结构中二硫键没有环合的艾卡拉肽多肽。说明书和权利要求书中所使用英文缩写的含义列于下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备艾卡拉肽的方法，包括下述步骤：（1）以2‑CTC树脂为载体分别合成肽树脂1、Fmoc‑Gly‑CTC树脂；2、Fmoc‑Arg(Pbf)‑CTC树脂；3、Fmoc‑Pro‑CTC树脂；4、Fmoc‑Ala‑CTC树脂，然后采用固相多肽合成方法分别将1、2、3、1和4肽树脂从C端到N端逐一偶联上带有Fmoc保护基的氨基酸，再经裂解液裂解得到相应的多肽片断A、B、C、D和E，其中多肽片段A为Fmoc‑Gln(Trt)‑Cys(Acm)‑Glu(OtBu)‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Tyr(tBu)‑Gly‑OH；多肽片段B为Fmoc‑Arg(Pbf)‑Trp(Boc)‑Phe‑Phe‑Asn(Trt)‑Ile‑Phe‑Thr(tBu)‑Arg(Pbf)‑OH；多肽片段C为Fmoc‑Pro‑Cys(Acm)‑Arg(Pbf)‑Ala‑Ala‑His(Trt)‑Pro‑OH；多肽片段D为Fmoc‑Phe‑Lys(Boc)‑Ala‑Asp(OtBu)‑Asp(OtBu)‑Gly‑OH；多肽片段E为Fmoc‑Glu(OtBu)‑Ala‑Met‑His(Trt)‑Ser(tBu)‑Phe‑Cys(Acm)‑Ala‑OH；（2）以王树脂为载体合成Fmoc‑Asp(OtBu)‑王树脂，然后采用固相多肽合成方法将其从C端到N端逐一偶联上带有Fmoc保护基的氨基酸，得到肽树脂F，其中带Fmoc保护基的氨基酸依次为Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH、Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、Fmoc‑Cys(Acm)‑OH、Fmoc‑Met‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Cys(Acm)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Phe‑OH、Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH、Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、Fmoc‑Gln(Trt)‑OH、Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、Fmoc‑Gly‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Cys(Acm)‑OH和Fmoc‑Gly‑OH；（3）将步骤（1）中带保护基的多肽片断按照A、B、C、D和E的顺序依次与肽树脂F以固相多肽合成方法偶联得到艾卡拉肽线性肽树脂；（4）对步骤（3）中的艾卡拉肽线性肽树脂进行裂解，得到包含六个‑Cys(Acm)‑片段的艾卡拉肽线性肽；（5）脱除步骤（4）的产物中‑Cys(Acm)‑片段上的Acm保护基，得到艾卡拉肽线性肽；（6）采用合适的氧化体系将步骤（5）的艾卡拉肽线性肽的三对二硫键环化，得到艾卡拉肽。...

【技术特征摘要】
1.一种制备艾卡拉肽的方法，包括下述步骤：
（1）以2-CTC树脂为载体分别合成肽树脂1、Fmoc-Gly-CTC树脂；
2、Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂；3、Fmoc-Pro-CTC树脂；4、
Fmoc-Ala-CTC树脂，然后采用固相多肽合成方法分别将1、2、
3、1和4肽树脂从C端到N端逐一偶联上带有Fmoc保护基的
氨基酸，再经裂解液裂解得到相应的多肽片断A、B、C、D和
E，其中
多肽片段A为
Fmoc-Gln(Trt)-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Tyr(t
Bu)-Gly-OH；
多肽片段B为
Fmoc-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Phe-Phe-Asn(Trt)-Ile-Phe-Thr(tBu)-
Arg(Pbf)-OH；
多肽片段C为
Fmoc-Pro-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Ala-Ala-His(Trt)-Pro-OH；
多肽片段D为
Fmoc-Phe-Lys(Boc)-Ala-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Gly-OH；
多肽片段E为
Fmoc-Glu(OtBu)-Ala-Met-His(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Cys(Acm)-Al
a-OH；
（2）以王树脂为载体合成Fmoc-Asp(OtBu)-王树脂，然后采用固相
多肽合成方法将其从C端到N端逐一偶联上带有Fmoc保护基
的氨基酸，得到肽树脂F，其中带Fmoc保护基的氨基酸依次
为Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、
Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、
Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、
Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、
Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、
Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、

\tFmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、
Fmoc-Cys(Acm)-OH和Fmoc-Gly-OH；
（3）将步骤（1）中带保护基的多肽片断按照A、B、C、D和E
的顺序依次与肽树脂F以固相多肽合成方法偶联得到艾卡拉
肽线性肽树脂；
（4）对步骤（3）中的艾卡拉肽线性肽树脂进行裂解，得到包含六
个-Cys(Acm)-片段的艾卡拉肽线性肽；
（5）脱除步骤（4）的产物中-Cys(Acm)-片段上的Acm保护基，得
到艾卡拉肽线性肽；
（6）采用合适的氧化体系将步骤（5）的艾卡拉肽线性肽的三对二硫
键环化，得到艾卡拉肽。
2.权利要求1的方法，其中，在步骤（1）中肽树脂1、2、3和4的
合成在碱性条件下进行，所述碱为DIPEA或TMP，优选DIPEA；CTC
树脂的替代度为0.5-1.0mmol/g，优选0.7...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱日成，宓鹏程，刘建，马亚平，袁建成，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44