一种快速鉴定驴皮、马皮和骡子皮的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术从马、驴和骡子的遗传背景出发，创新性的同时使用CKM核基因(nDNA)和线粒体基因组DNA(mtDNA)的16SrRNA基因对驴、马、马骡和驴骡进行准确的鉴别，本试剂盒采用分子信标探针(MB)法进行5重多色荧光定量PCR检测技术，同时能检测驴、马、马骡及驴骡四种成分，而且本试剂盒中加入外源性内参作为内标，可检测和避免因样本含有PCR抑制物而产生的假阴性结果。5重多色荧光定量PCR是在同一管内检测，无需开盖，不易污染，具有准确稳定、操作简单，灵敏度极高特异性强等有益效果，为驴皮、马皮及骡子皮的鉴定探索了新的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种快速鉴定动物物种的方法，特别涉及利用一种分子信标探针(MB)荧光定量PCR检测法鉴定驴皮、马皮和骡子皮的检测方法及试剂盒。
技术介绍
阿胶为马科动物驴的去毛之皮经熬制而成的胶状物，医疗保健价值极高，具有补血养血、美容养颜、延年益寿、强筋健骨，增强免疫力等五大功能优势，因此阿胶作为一种保健食品在市场上占有重要的位置，深受消费者的青睐。然而随着胶类市场的不断发展，随着熬胶原料供应的紧张和原料价格上涨，目前一些不法分子在利益的驱使下，用马皮、骡子皮、牛皮或者猪皮等低廉皮张冒充驴皮现象越来越多，为医药保健品市场安全带来巨大隐患。当前毛皮鉴定方法滞后，国内外动物毛皮的鉴定仍然没有统一的技术标准或较成熟的鉴别方法，传统的宏观观察法、显微镜观察法具有一定主观性，无法准确和快速的区分皮张，对于形态相似的马皮，骡子皮和驴皮则更加难以区分。近年来随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，DNA分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它可以突破依据动物纤维结构形态的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。其中，公开号为CN1605868A的专利所述方法是通过选取细胞色素B基因聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性方法制备的DNA指纹图谱来鉴定，但该方法不能对骡子与驴或骡子与马加以区分。其原因在于：从骡子的遗传背景分析，母马与公驴所生的种间杂种叫马骡，反之母驴配公马所生的种间杂种叫驴骡。马骡和驴骡在形态结构、生理特性和生活习性方面的差异，主要有细胞质遗传和遗传印记共同作用的结果。马和驴在正反交中，受精卵的核基因相同。由马的32条染色体和驴的31条染色体提供；受精卵的质基因不同，马骡主要由母马卵细胞的线粒体提供，驴骡主要有母驴卵细胞的线粒体提供。如果是驴骡，同样有驴的线粒体基因，如果是马骡就含有马的线粒体基因，所以仅利用线粒体细胞色素B基因无法同时鉴别马、驴与骡子。因此，本专利技术首次将线粒体16SrRNA基因和核基因结合，建立的一种快速鉴别驴皮、马皮、骡子皮的荧光定量检测方法对阿胶原料驴皮的快速鉴定具有重要的创新性实践意义，填补了国内外马科动物种属鉴定方法的空白。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴定动物物种的方法，特别涉及一种分子信标探针(MB)荧光定量PCR检测法鉴定驴皮、马皮、骡子皮的方法及试剂盒。为实现上述目的，该试剂盒包括马和驴共有的一对核基因CKM引物及对应的马和驴2种核基因特异探针，一对马和驴线粒体16SrRNA基因的共有引物及对应的2种特异检测探针，另外还有一组外源性内参体系：包括人工合成一种外源性内参序列并构建的质粒载体作模板，和对应的外源引物及探针，可检测和避免因样本含有PCR抑制物而产生的假阴性结果。本专利技术从马、驴和骡子的遗传背景出发，创新性的同时选择了CKM核基因(nDNA)，以及线粒体基因组DNA(mtDNA)的16SrRNA基因进行分析，设计分子信标探针(MB)特异探针作为鉴定马、驴和骡子的依据，其理由：一是从骡子的遗传背景分析，母马与公驴所生的种间杂种叫马骡，反之母驴配公马所生的种间杂种叫驴骡。马和驴在正反交中，受精卵的核基因相同。由马的32条染色体和驴的31条染色体提供；受精卵的质基因不同，马骡主要由母马卵细胞的线粒体提供，驴骡主要有母驴卵细胞的线粒体提供。因此，可以推断出：当待测样本检出马、驴的核基因以及驴的线粒体基因时就可以确定为驴骡；当待测样本检出马，驴的核基因以及马的线粒体基因时即为马骡；当待测样本只有马基因与马线粒体时，即为马；当待测样本既有驴的核基因又有驴线粒体基因时即为驴。二是：本专利技术根据相关文献报道克隆得到CKM基因及线粒体mtDNA基因组上的16SrRNA基因，对两种基因序列分析比对发现在马与驴物种间基因序列具有稳定性遗传差异，以此设计马和驴的特异探针。分子信标具有高灵敏性，高特异性、相较于TaqMan探针荧光本底低，不仅可以用于基因的定量、定性检测，还可以应用到基因点突变等分析，基于这些优点，本试剂盒采用分子信标探针(MB)法进行5重五色荧光定量PCR检测技术，同时能检测驴、马、驴骡及马骡四种成分，而且本试剂盒中加入外源性内参作为内标，可检测和避免因样本含有PCR抑制物而产生的假阴性结果。本试剂盒包括：PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增的驴、马、驴骡及马骡的引物混合物，对上述物种进行特异检测的分子信标探针混合物，以及内标引物，人工构建的内标质粒及探针混合物。本试剂盒在引物设计方面：根据NCBI数据库中查找驴和马的CKM核基因(nDNA)及线粒体mtDNA基因组上的16SrRNA基因序，应用同源分析工具Claster软件对其同源性比对，利用引物设计软件Primer5.0根据筛选出的核心片段两端相似序列设计一对通用引物，使用BeaconDesigner2.0设计特异分子信标(MB)探针，设计好的探针进一步用在线软件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold)确定其二级结构，设计好的探针、引物NCBI数据库中BLAST分析其特异性，探针分别采用5种不同发光基团，对各个探针的5’端进行荧光素修饰，马的nDNA特异探针(CKM-MP)用CY3标记，驴的nDNA特异探针(CKM-LP)用ROX标记，马的mtDNA探针(mtMP)用FAM标记，驴的mtDNA探针(mtLP)用JOE标记，内标探针(IACP)用CY5标记，3’端的淬灭基团均用Dabcyl修饰。用于快速准确鉴定驴皮、马皮、骡子皮的检测试剂盒所使用的引物为：马和驴CKM核基因(nDNA)通用引物：CKMF:5'AAGAAGCTGCGGGACAAGG3'CKMR:5'CAGCCCACGGTCATGATGA3'马的CKM核基因特异探针：CKM-MP：5'CGCGAGAGTGGAAAGAATGAGAGGCAGAACTCGCG3'驴的CKM核基因特异探针：CKM-LP：5'CGCGAGAGTGGAAAAAATGAGAGGCAGAACTCGCG3'马和驴的线粒体16SrRNA基因通用引物：MtUF:5'ATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGC3'MtUR:5'AGGATTTTCTGTTCTCCGAGGTCAC3'马的线粒体16SrRNA基因特异探针：mtMP：5'CGCCACAAACCTAACCTTCAGGGACAGGCG3'...

【技术保护点】
一种鉴定驴皮、马皮、骡子皮的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用的引物和探针为：马和驴CKM核基因(nDNA)通用引物：CKMF:5'AAGAAGCTGCGGGACAAGG3'CKMR:5'CAGCCCACGGTCATGATGA3'马的CKM核基因特异探针：CKM‑MP：5'CGCGAGAGTGGAAAGAATGAGAGGCAGAACTCGCG3'驴的CKM核基因特异探针：CKM‑LP：5'CGCGAGAGTGGAAAAAATGAGAGGCAGAACTCGCG3'马和驴的线粒体16SrRNA基因通用引物：MtUF:5'ATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGC3'MtUR:5'AGGATTTTCTGTTCTCCGAGGTCAC3'马的线粒体16SrRNA基因特异探针：mtMP：5'CGCCACAAACCTAACCTTCAGGGACAGGCG3'驴的线粒体16SrRNA基因特异探针：mtLP：5'CGCCAAACCTAACCCTCAGGGACAACCGCC3'内参引物：IACF:5’ACCGTTACCGAGTCCAGGTG‑3’IACR:5’TTCGGACTCGATCAGAGCAC‑3’内参探针：IACP：5’‑CGACGGTCCTTTCTAATGTTGCGTCG‑3’。...

【技术特征摘要】
1.一种鉴定驴皮、马皮、骡子皮的检测试剂盒，其特征在于，所述
试剂盒使用的引物和探针为：
马和驴CKM核基因(nDNA)通用引物：
CKMF:5'AAGAAGCTGCGGGACAAGG3'
CKMR:5'CAGCCCACGGTCATGATGA3'
马的CKM核基因特异探针：
CKM-MP：5'
CGCGAGAGTGGAAAGAATGAGAGGCAGAACTCGCG3'
驴的CKM核基因特异探针：
CKM-LP：5'
CGCGAGAGTGGAAAAAATGAGAGGCAGAACTCGCG3'
马和驴的线粒体16SrRNA基因通用引物：
MtUF:5'ATAAGACG...

【专利技术属性】
技术研发人员：张全芳，步迅，刘艳艳，
申请(专利权)人：山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37