本发明专利技术涉及一种辣椒花药培养获得单倍体植株的方法，属于农业技术领域。包括选取花蕾，花蕾消毒，花药接种，预处理，花药培养，诱导愈伤组织再分化为单倍体植株。本发明专利技术采用固体培养基将小孢子和花药壁共培养，低温、热激预处理，调节愈伤诱导、分化培养基成分和培养条件，提高了愈伤率和愈伤组织的分化能力。应用此方法进行辣椒花药培养，愈伤诱导率60％以上，出苗率80％以上，解决了辣椒花药培养诱导率低的难题。本发明专利技术可快速获得单倍体再生植株，出苗率高，为新品种选育提供有力的手段。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种辣椒花药培养获得单倍体植株的方法，属于农业
。包括选取花蕾，花蕾消毒，花药接种，预处理，花药培养，诱导愈伤组织再分化为单倍体植株。本专利技术采用固体培养基将小孢子和花药壁共培养，低温、热激预处理，调节愈伤诱导、分化培养基成分和培养条件，提高了愈伤率和愈伤组织的分化能力。应用此方法进行辣椒花药培养，愈伤诱导率60％以上，出苗率80％以上，解决了辣椒花药培养诱导率低的难题。本专利技术可快速获得单倍体再生植株，出苗率高，为新品种选育提供有力的手段。【专利说明】
： 本专利技术属农业领域，具体涉及。 技术背景： 辣椒是重要的蔬菜作物之一，栽培普遍而广泛。辣椒杂种优势十分显著，目前多采 用常规育种手段选育新品种，育种周期长，进展缓慢，未被利用的辣椒种质材料日益减少， 种质资源匮乏。 花药培养是在单细胞水平上获得纯系的有效方法，是重要的育种辅助手段。花药 培养能够快速固定和保存有利基因，可用于远缘杂交新类型的培育和稳定，以及选择特异 性状，作为育种基础材料；花药培养，可快速实现高度遗传纯合性，缩短育种年限，提高育种 效率，加快育种进程。 辣椒花药培养受材料基因型、花药发育时期、预处理、培养基成分和培养条件等因 素的影响，导致辣椒花药培养的诱导率低，获得单倍体非常困难，生产上应用极少。
技术实现思路
： 本专利技术目的在于针对
技术介绍
提出的辣椒花药培养效率低问题，提供一种辣椒花 药培养获得单倍体再生植株的方法。 本专利技术的目的通过以下技术方案实现： -种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法，包括以下步骤： (1)取花粉发育处于单核中后期的花药； (2)接种至预处理培养基上，预处理； ⑶将预处理后的花药，在24°C?28°C条件下暗培养6?7d至花药顶端出现黄 白色组织后，转接至愈伤组织诱导培养基，在昼温25土 1°C /夜温22±1°C、光照2000? 3000LX、光周期14h · cT1条件下培养20?30d获得愈伤组织； (4)将愈伤组织转接至1/2MS分化培养基上，在昼温25土 1°C /夜温22土 1°C、光 照3000?4000LX、光周期16h · cT1条件下分化培养至愈伤组织直径为1?2cm，然后转接 至MS分化培养基继续培育获得再生植株； (5)移栽。 所述的预处理培养基为 MS+0. lmg · L 1 ?0· 2mg · L 4-D+O. 5mg · L 1 ? 1. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼脂，ρΗ5· 8 ?6 培养基。 所述预处理的过程为：置于4°C暗处理45?50h，再移至36°C处理120?150h。 所述的愈伤组织诱导培养基为MS+0. lmg · Γ1?0. 25mg · Ll, 4-D+l. Omg · I71? 3. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼月旨，ρΗ5· 8 ?6。 所述 1/2MS 分化培养基为 1/2MS+0. Olmg · L 1 ?0· 02mg · L ΑΑΑ+^ι· Omg · L 1 ? 6. Omg · L iT+l· Omg · L 1 ?5. Omg · L WcC 维生素 C)+2 % ?3 % 鹿糖 +0· 6 % ?0· 8 % 琼 月旨，ρΗ5· 8?6 ;所述的MS分化培养基为MS+0. Olmg · L 1?0· 02mg · L ^ΑΑ+Θ. Omg · L 1? 8.〇11^*]^11(丁+5.〇11^*]^1?10.〇11^*]^1￥〇+2 (%?3(%鹿糖+0.6(%?0.8(%琼月旨，卩!15.8? 6。 本专利技术所述培养基中蔗糖和琼脂的浓度单位为质量百分比。 步骤（5)中所述移栽的过程为：提前2d打开瓶盖，然后取出再生植株，洗净培养 基，50 %多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡，晾干后移植于装有灭菌蛭石和珍珠岩（体积比 2:1)的穴盘；置于育苗棚内驯化30?35d后定植于棚室。 步骤（1)中所述单核中后期花药的取出过程为：植株盛花期于晴天上午9:00? 11:00采集花蕾，醋酸洋红染色压片法镜检鉴定花粉发育时期，选取处于单核中后期花蕾； 花蕾消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20?30min;然后依次用70 % (体积百分比）乙醇溶 液浸0. 5min，6. 0 %次氯酸钠溶液（取市售次氯酸钠分析纯6. 0ml加水定容至100ml)消毒 15min，最后用无菌水冲洗3?4次；无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离、取出。 本专利技术方法的最优选技术方案为： (1)取花粉发育处于单核中后期的花药 取样：植株盛花期于晴天上午9:00?11:00采集花蕾。醋酸洋红染色法镜检鉴定 花粉发育时期，选取花粉发育处于单核中后期的花蕾。 花蕾消毒：花蕾洗涤灵清洗，流水冲洗20?30min ;超净工作台内，花蕾70%乙醇 溶液浸〇. 5min，然后用6. 0%的次氯酸钠溶液消毒15min，最后用无菌水冲洗3?4次，每次 5min。无菌条件下，将花药从花蕾中完整剥离、取出。 (2)接种至预处理培养基上，预处理 将取出的花药接种于预处理培养基上，Parafilm封口膜封口。花药壁组织与小孢 子共培养，能提高愈伤组织的诱导频率。 所述的预处理培养基为 MS+0. lmg · L 1 ?0· 2mg · L 4-D+O. 5mg · L 1 ? 1. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼脂，ρΗ5· 8 ?6 培养基。 预处理：接种后，置于4°C暗处理45?50h，再移至36°C处理120?150h。通过预 处理可显著提高愈伤组织诱导频率。 (3)愈伤组织诱导：预处理后移至24°C?28°C组织培养室中暗培养。6?7d后花 药顶端现黄白色组织，转接至愈伤组织诱导培养基上，置于昼温25 ± 1 °C /夜温22 ± 1 °C、光 照2000?3000LX、光周期14h · cf1条件下培养获得愈伤组织。花药壁组织与小孢子共培 养，能提高愈伤组织的诱导频率。 所述的愈伤组织诱导培养基为MS+0. lmg · Γ1?0. 25mg · Ll, 4-D+l. Omg · I71? 3. Omg · L-1KT+2%?3%蔗糖 +0· 6%?0· 8%琼月旨，ρΗ5· 8 ?6。 (4)植株再生：培养20?30d后，将愈伤组织接种到1/2MS分化培养基上，置于昼 温25±1°C /夜温22±1°C、光照3000?4000LX、光周期16h · (Γ条件下培养。培养18? 24d后，愈伤组织直径1?2cm，接种于MS分化培养基上进行培养；8?12d后愈伤组织周 围可见黄绿色小点，并逐渐发育成小苗。 所述 1/2MS 分化培养基为 1/2MS+0. Olmg · L 1 ?0· 02mg · L ΑΑΑ+^ι· Omg · L 1 ? 6.〇11^*]^11(丁+1.〇11^*]^1?5.〇11^*]^ 1\^+2(%?3(%鹿糖+0.6(%?0.8(%琼月旨，卩!15.8?6; 所述的 M本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)取花粉发育处于单核中后期的花药；(2)接种至预处理培养基上，预处理；(3)将预处理后的花药，在24℃～28℃条件下暗培养6～7d至花药顶端出现黄白色组织后，转接至愈伤组织诱导培养基，在昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照2000～3000LX、光周期14h·d‑1条件下培养20～30d获得愈伤组织；(4)将愈伤组织转接至1/2MS分化培养基上，在昼温25±1℃/夜温22±1℃、光照3000～4000LX、光周期16h·d‑1条件下分化培养至愈伤组织直径为1～2cm，然后转接至MS分化培养基继续培育获得再生植株；(5)移栽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张燕燕，黄忠阳，魏猷刚，唐懋华，缪其松，刘叶琼，胡静，孙雪花，
申请(专利权)人：南京市蔬菜科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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