固相萃取和气相色谱联用测定结构脂α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的方法技术

一种固相萃取和气相色谱联用测定结构脂α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的方法，先利用纯的花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亚麻酸-甘油一酯、油酸-游离脂肪酸标准品，通过优化不同极性配比的洗脱液洗脱条件，在同一根SPE小柱上实现混合物中TAG、DAG、MAG、FFA的有效分离，其特征在于它包括如下步骤：1)混合标准样品的分离和脂肪酸组成分析；2)结构脂α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的分析。该方法具有操作简便、样品需求量低、需要溶剂消耗量少、定性定量分析结果准确、检测限低、分析时间快的优点，可实现结构脂α、β位置脂肪酸组成和结构脂产品中TAG、DAG、MAG、FFA组成与含量的高通量检测。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种，先利用纯的花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亚麻酸-甘油一酯、油酸-游离脂肪酸标准品，通过优化不同极性配比的洗脱液洗脱条件，在同一根SPE小柱上实现混合物中TAG、DAG、MAG、FFA的有效分离，其特征在于它包括如下步骤：1)混合标准样品的分离和脂肪酸组成分析；2)结构脂α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的分析。该方法具有操作简便、样品需求量低、需要溶剂消耗量少、定性定量分析结果准确、检测限低、分析时间快的优点，可实现结构脂α、β位置脂肪酸组成和结构脂产品中TAG、DAG、MAG、FFA组成与含量的高通量检测。【专利说明】固相萃取和气相色谱联用测定结构脂α、β位置脂肪酸及 甘油酯组成的方法
本专利技术涉及一种检测结构脂的方法，具体涉及一种固相萃取和气相色谱联用测定 结构脂α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的方法。
技术介绍
脂质是人类膳食的主要组成部分，在人体三大能量营养素中占有重要的地位。随 着人们生活水平的不断提高，人类对膳食中脂质的营养提出了新的要求。吃好油、吃营养健 康油，已成为我国消费者关注自身健康、保证正常营养摄取的新需求。 研究表明，油脂中TAGS的含量高达95%以上。TAGS中脂肪酸的组成、碳链长短、 双键数目及位置是影响油脂物理化学性质及营养价值的重要因素，尤其是甘油骨架上脂肪 酸的位置分布对甘油酯在人体内的吸收代谢及其营养价值具有重要影响。甘油酯中脂肪酸 的位置可以分为两大类，S卩a (Sn-1，3)位和β (Sn-2)位。在人体的胃肠道内，胰脂肪酶是 消化脂质的最主要酶，具有较高的α位专一性。酰基在α位上，脂肪酸以游离的形式被吸 收，而酰基在β位时，则是以单甘酯的形式被吸收，且β位单甘酯更易被人体吸收利用。甘 油酯的这种"脂肪酸酰化位置效应"对于指导功能油脂产品的研发有着非常重要的意义。 结构脂质（StructuredLipid，SLs)，通过改变三酰甘油骨架上脂肪酸组成及位置 分布，将具有特殊营养或生理功能的脂肪酸结合到特定位置，从而充分发挥各种脂肪酸的 物理和营养功能性质。结构脂作为一类新型功能性油脂，其开发与应用程度越来越广。在 合成SLs的过程中，常伴随着TAG、DAG、MAG、FFA的产生。产物中TAG、DAG、MAG、FFA的分离 是优化反应条件、鉴定反应产物的前提。此外，建立一种高通量的快速有效测定SLs中α、 β位置脂肪酸组成的方法，在SLs研究工作中有着重要的现实意义。 -直以来，分离TAG、DAG、MAG、FFA的方法主要是TLC法和正相高效液相色谱法 (NP-HPLC)。TLC法的制板、平衡、分离、提取等操作比较复杂，被测样品经过点样后暴露在 空气中，增加了脂肪酸的氧化几率，尤其是对于一些长碳链多不饱和脂肪酸（LCPUFAs)影 响较大。另外，由于TLC法难于定量，且存在用时长、受操作者操作水平的影响较大等缺点， 因此，只能作为定性分析的一种辅助手段，从而限制了它的进一步应用。而NP-HPLC仪器昂 贵，且需要先记录相应标准品的保留时间，在进行样品分析时，需要按照各个组分的保留时 间分别收集各个组分，经GC进行脂肪酸检测，因此存在有机溶剂消耗大、费时等缺点。相对 于传统的TLC法和HPLC法，固相萃取技术具有有机溶剂消耗少、富集倍数高，能有效对SLs 合成产物中TAG、DAG、MAG、FFA快速有效分离等特点，结合GC法，能实现测定结构脂α、β 位置脂肪酸及甘油酯的组成分析。本专利技术对固相萃取小柱分离TAG、DAG、MAG及FFA的洗脱 条件进行优化，建立了采用商品化的固相萃取小柱完成了 SLs合成过程中产生的TAG、DAG、 MAG、FFA的快速有效分离，结合GC法，实现了 SLs中α、β位置脂肪酸及甘油酯的组成分 析，该方法操作简便，快速有效，便于批量处理样品。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种固相萃取和气相色谱联用测定结构脂α、β位置脂 肪酸及甘油酯组成的方法，该方法具有操作简便、样品需求量低、需要溶剂消耗量少、定性 定量分析结果准确、检测限低、分析时间快的优点。 为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种固相萃取和气相色谱联用测 定结构脂α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的方法，先利用纯的花生四烯酸-甘油三酯 (ARA-TAG)、二十二碳六烯酸-甘油二酯（DHA-DAG)、亚麻酸-甘油一酯（Ln-MAG)、油酸-游 离脂肪酸（0-FFA)标准品，通过优化不同极性配比的洗脱液洗脱条件，在同一根SPE小柱上 实现混合物中TAG、DAG、MAG、FFA的有效分离，其特征在于它包括如下步骤： 1)混合标准样品的分离和脂肪酸组成分析 (1)样品制备：分别称取花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亚麻 酸-甘油一酯、油酸-游离脂肪酸标准品，按花生四烯酸-甘油三酯：二十二碳六烯酸-甘油 二酯：亚麻酸-甘油一酯：油酸-游离脂肪酸的质量比为5-50mg:5-50mg:5-50mg:5-50mg， 混合，用正己烧溶解，质量浓度控制在5mg/mL?50mg/mL之间，得到样品，并置于-20°C冰箱 保存； (2)柱子活化：将固相萃取小柱置于固相萃取装置上，用5-10倍固相萃取小柱内 的填料体积的正己烷对柱子进行平衡活化（为常规方法；正己烷为填料体积的5-10倍）； 固相萃取小柱内填料为弗罗里硅土； (3)上样：将步骤（1)中配制的样品转移到固相萃取小柱中，样品上样体积为固相 萃取小柱内的填料体积的1-2倍，控制流速<5mL/min ; (4)洗脱：用不同极性配比的洗脱液正己烷：无水乙醚=85 :15、70 :30、25 :75(v/ v)(即三种正己烷与无水乙醚的配比，前三组洗脱液为三组不同配比的正己烷和无水乙醚 的混合物），无水乙醚：冰醋酸=95 :5(v/v)(第四组洗脱液为无水乙醚和冰醋酸的混合 物）分别淋洗柱子，分别收集洗脱液，氮吹仪下吹干洗脱液，得洗脱物； (5) TLC检测：向步骤（4)收集的洗脱物中加入正己烷，质量浓度控制在5mg/mL? 50mg/mL之间，涡旋混匀，得洗脱样品；取洗脱样品点样于硅胶板（10cmX2〇 Cm)，置于层析 缸中进行薄层层析（按常规方法进行层析），所用展层剂为正己烷：无水乙醚：冰醋酸= 50 :50 :1 (v/v/v)(展层剂为正己烷、无水乙醚和冰醋酸的混合物），自然晾干后，置于碘蒸 汽中显色至斑点完全显现，观察花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亚麻 酸-甘油一酯、油酸-游离脂肪酸是否实现分离，并确定各洗脱物的类型； (6)GC检测：将步骤（4)收集的洗脱物进行甲酯化衍生化处理（按常规方法进 行），根据步骤（5)的结果判断洗脱物的种类，对于脂肪酸的甲酯化反应采用浓H 2S04/甲 醇加热法进行，对于甘油酯的甲酯化反应采用Κ0Η/甲醇法进行（按常规方法进行）；取步 骤（5)洗脱样品50yL，溶于2mL石油醚，振荡l-2s，加入lmL5% (v/v)的浓H2S04/甲醇 溶液（浓H2S04浓度为98% )或者lmLO. 4mol/L(摩尔浓度）Κ0Η/甲醇溶液，涡旋5min， 然后加入2mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固相萃取和气相色谱联用测定结构脂α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的方法，其特征在于它包括如下步骤：1)混合标准样品的分离和脂肪酸组成分析(1)样品制备：分别称取花生四烯酸‑甘油三酯、二十二碳六烯酸‑甘油二酯、亚麻酸‑甘油一酯、油酸‑游离脂肪酸标准品，按花生四烯酸‑甘油三酯：二十二碳六烯酸‑甘油二酯：亚麻酸‑甘油一酯：油酸‑游离脂肪酸的质量比为5‑50mg:5‑50mg:5‑50mg:5‑50mg，混合，用正己烷溶解，质量浓度控制在5mg/mL～50mg/mL之间，得到样品，并置于‑20℃冰箱保存；(2)柱子活化：将固相萃取小柱置于固相萃取装置上，用5‑10倍固相萃取小柱内的填料体积的正己烷对柱子进行平衡活化；固相萃取小柱内填料为弗罗里硅土；(3)上样：将步骤(1)中配制的样品转移到固相萃取小柱中，样品上样体积为固相萃取小柱内的填料体积的1‑2倍，控制流速<5mL/min；(4)洗脱：用不同极性配比的洗脱液正己烷：无水乙醚＝85：15、70：30、25：75(v/v)，无水乙醚：冰醋酸＝95：5(v/v)分别淋洗柱子，分别收集洗脱液，氮吹仪下吹干洗脱液，得洗脱物；(5)TLC检测：向步骤(4)收集的洗脱物中加入正己烷，质量浓度控制在5mg/mL～50mg/mL之间，涡旋混匀，得洗脱样品；取洗脱样品点样于硅胶板，置于层析缸中进行薄层层析，所用展层剂为正己烷：无水乙醚：冰醋酸＝50：50：1(v/v/v)，自然晾干后，置于碘蒸汽中显色至斑点完全显现，观察花生四烯酸‑甘油三酯、二十二碳六烯酸‑甘油二酯、亚麻酸‑甘油一酯、油酸‑游离脂肪酸是否实现分离，并确定各洗脱物的类型；(6)GC检测：将步骤(4)收集的洗脱物进行甲酯化衍生化处理，根据步骤(5)的结果判断洗脱物的种类，对于脂肪酸的甲酯化反应采用浓H2SO4/甲醇加热法进行，对于甘油酯的甲酯化反应采用KOH/甲醇法进行；取步骤(5)洗脱样品50μL，溶于2mL石油醚，振荡1‑2s，加入1mL5％(v/v)的浓H2SO4/甲醇溶液或者1mL0.4mol/LKOH/甲醇溶液，涡旋5min，然后加入2mL0.9％(w/v)的氯化钠水溶液，轻微振荡5‑10秒，5000rpm离心5min，最后取上清液进行GC分析；得GC色谱图，数据分析，计算各脂肪酸的百分含量；(7)根据步骤(6)中脂肪酸组成，结合步骤(5)中各洗脱物的类型，得到甘油三脂、甘油二酯、甘油一酯和游离脂肪酸的脂肪酸组成；2)结构脂α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的分析(1)对于结构脂α、β位置脂肪酸组成的分析，称取300mg结构脂于30mL玻璃试管中，加20mg猪胰脂酶，2mLTris‑HCl缓冲液，摇匀后，加0.5mL胆酸钠溶液，0.2mLCaCl2溶液，涡旋混匀后，于40℃水浴锅中震荡反应5min后，加入1mL无水乙醚，1mLHCl溶液，震荡均匀后，5000r/min离心2min，取上层，氮吹吹干得样品；(2)将步骤(1)中的样品按步骤1)中(2)‑(6)进行，根据猪胰脂酶对α位置脂肪酸水解的专一性，得到甘油一酯和游离脂肪酸的组成，确定结构脂α、β位置的脂肪酸组成；(3)对于结构脂甘油酯组成的分析，其样品按步骤1)中(2)‑(7)进行，确定甘油酯的组成。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：董绪燕，刘四磊，吴琳，陈洪，魏芳，吕昕，钟娟，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42