本发明专利技术涉及一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用，所述的黑根霉胞外多糖的制备方法如下：(1)取菌种保藏号为CGMCC NO.8436的黑根霉，经活化和发酵培养，制得发酵液；(2)将发酵液经分离纯化，制得粗提液；(3)将粗提液经树脂柱脱色，Seveage试剂振荡脱蛋白，Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱层析纯化，制得黑根霉胞外多糖。本发明专利技术利用黑根霉胞外多糖通过建立动物肿瘤模型，对黑根霉胞外多糖的实体抗消化道系统肿瘤活性进行探究，动物肿瘤实验抗肿瘤结果表明，黑根霉胞外多糖可以明显抑制胃癌肿瘤小鼠、结肠癌肿瘤小鼠的肿瘤块的生长，并且和现有化疗药物环磷酰胺联合用药抗肿瘤疗效明显高于环磷酰胺单独用药的抗肿瘤效果。
【技术实现步骤摘要】
一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中 的应用
本专利技术涉及一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用，属 于医药及保健食品
。
技术介绍
随着社会的发展和经济的快速提高，人民的生活节奏加快、方式多样化，以及大气 环境污染的日趋加重、人口老龄化加剧等因素，导致亚健康人群剧增，我国的恶性肿瘤的发 病率及死亡率不断增长，如今癌症死亡率已经上升到首位，且成为人民日益关注的社会问 题。消化道肿瘤是世界范围内的常见恶性肿瘤，主要包括胃癌、食管癌、大肠癌以及肝癌。随 着我国人民生活水平的提高及饮食结构的改善及不良生活习惯的日积月累，我国已经成为 消化道肿瘤高发地区，其发病率和死亡率抑制位于恶性肿瘤前列。据统计，平均每小时就有 120个中国人死于消化道癌症，其中肝癌的发病率已经是世界之首，结直肠癌以每年3. 9% 的幅度不断攀升，胃癌患者人数占世界的50%，消化道肿瘤严重威胁着中国人的生命和健 康。肿瘤的治疗方法主要包括药物治疗，放射治疗和手术治疗。各种治疗均能够杀死一定的 肿瘤细胞，但是都存在各自的弊端，不能彻底治愈肿瘤。化疗是消化道治疗常用的方法，但 化疗药物对靶点的选择性差，在杀伤肿瘤细胞时对机体的正常免疫细胞也具有杀伤作用， 同时化疗药物可引起恶心和呕吐，引起营养不良，使患者免疫力严重下降。化疗药物产生的 副作用和其引发的过敏反应限制了其临床应用，并且上述化疗治疗方法费用昂贵、预后较 差。所以寻求一种针对消化道系统癌症疗效显著、副作用小、费用低廉的抗肿瘤药物和治疗 方法具有重要意义。 真菌多糖抗肿瘤药物属于中医药抗肿瘤药物的重要组成部分，我国真菌资源丰 富，早在《神农本草经》中就对赤芝草、茯苓等真菌的扶正固本效用做了介绍。真菌多糖是 真菌发挥功效的主要成分，分离于真菌子实体、菌丝体及发酵液中，由10个以上单糖分子 主要以β_1，3和β-1，6糖苷键连接而成的天然高分子化合物。很多研究表明多种真菌多 糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗辐射等多种生物活性且毒性很低，现已成为开 发癌症治疗药物的重要来源之一。我国对真菌多糖的研究近年取得很大的进展。有实验研 究表明，香菇多糖已应用于治疗胃肠道肿瘤，治疗过程中机体的免疫球蛋白含量提高，相关 细胞因子、⑶3、⑶4、⑶4/⑶8比值明显升高，血小板和白细胞含量也有所提高，并且香菇多 糖、云芝多糖、灰树花多糖等作为抗肿瘤辅助药物已进入临床应用。 除了传统的大型真菌来源的真菌多糖，许多研究表明霉菌来源的多糖也同样具有 多种生物学活性，因其成本低廉、培养易操作等优势，开始受到关注。 黑根霉（R. nigricans Ehrenb.)是一种丝状真菌，具有很强的生长势，液体发酵培 养过程中分泌大量的胞外多糖。黑根霉胞外粗多糖包含多种组分，采用不同的分离纯化方 法可以获得不同的均一多糖。前期研究表明黑根霉胞外多糖具有显著体外抗人胃癌细胞 SGC-7901、人白血病细胞K562、小鼠腹水瘤细胞S180体外增殖的活性，并且促进脾淋巴细 胞体外增殖和IL-2的分泌。目前，黑根霉胞外多糖的功能性研究已成为黑霉菌研究的热 点，但黑根霉胞外多糖对抗实体瘤，特别是抗消化道系统肿瘤活性的研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有抗消化道类肿瘤药物不足，提供一种黑根霉胞外多糖在制备治疗 或预防消化道肿瘤药物中的应用。 一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用，其特征在于， 所述的黑根霉胞外多糖的制备方法如下： (1)取菌种保藏号为CGMCC N0. 8436的黑根霉接种于PDA培养基中，在25?30°C 的条件下活化培养3?5d，制得活化后的菌丝；将活化后的菌丝转接于液体培养基中，在 25?30°C、100?200rpm/min的条件下培养5?10d，制得发酵液； (2)将步骤（1)制得的发酵液经固液分离，收集分离后的液体，经浓缩后，在室温 条件下，向浓缩液中加入3?4倍体积的体积百分比为95%的酒精，静置后，分离沉淀，将沉 淀溶于蒸馏水中，再次分离沉淀，取上清液，制得粗提液； (3)将步骤（2)制得的粗提液经D301-R型树脂柱脱色，收集洗脱液，然后加入洗脱 液体积1/4的Seveage试剂振荡脱蛋白，取上清液，除去有机溶剂，制得粗糖溶液，然后将粗 糖溶液经过S印hadex G-50葡聚糖凝胶柱层析纯化，经蒸馏水洗脱，流度为5mL/min，检测合 并收集高峰区的多糖洗脱液，将洗脱液进行浓缩、冷冻干燥，制得黑根霉胞外多糖。黑根霉 胞外多糖为淡黄色粉末状固体。 所述步骤（1)中，PDA培养基每升组分如下： 马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15g，自来水定容至1L。 液体培养基每升组分如下： 液体PDB发酵培养基，每升组分如下：马铃薯200g，蔗糖20g，自来水定容至1L。 根据本专利技术优选的，所述步骤（2)中，浓缩为在55?60°C的条件下经旋转蒸发进 行浓缩。 根据本专利技术优选的，所述步骤（2)中，浓缩后浓缩液体积为浓缩前液体体积的三 分之一。 根据本专利技术优选的，所述步骤（2)中，分离沉淀为在12000rpm/min的条件下离心 15min〇 根据本专利技术优选的，所述步骤（3)中，Seveage试剂为氯仿与正丁醇按体积比4:1 的比例混合制得。 根据本专利技术优选的，所述步骤（3)中，检测为采用苯酚-硫酸法检测糖含量。 所述的黑根霉胞外多糖由两种多糖组分EPS-1和EPS-2构成，又进一步从EPS-1 中分离纯化出了 EPS1-1。EPS1-1和EPS-2为组分均一的多糖，分子量分别为9682Da 和1.979X 105Da。EPS1-1主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及果糖组成，其摩尔比例为： 5. 89:3. 64:3. 2:1。EPS-2主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖以及少量未知化合物组成，半乳 糖、鼠李糖、阿拉伯糖、摩尔比例为：17.8:2. 3:1。 根据本专利技术优选的，所述的肿瘤药物包括药效成分为黑根霉胞外多糖与环磷酰胺 以及药学上可接受的辅料。 根据本专利技术进一步优选的，所述的黑根霉胞外多糖与环磷酰胺的质量比为1 : (3. 5?4);最优的，黑根霉胞外多糖与环磷酰胺的质量比为1 :3. 75。 根据本专利技术进一步优选的，所述的消化道肿瘤为胃癌与结肠癌。 有益效果 本专利技术利用黑根霉胞外多糖（EPS)通过建立动物肿瘤模型，如裸鼠胃癌模型、裸 鼠结肠癌模型，sl80昆明鼠肉瘤模型等，对黑根霉胞外多糖的实体抗消化道系统肿瘤活性 进行探究，动物肿瘤实验抗肿瘤结果表明，黑根霉胞外多糖可以明显抑制胃癌肿瘤小鼠、结 肠癌肿瘤小鼠的肿瘤块的生长，并且和现有化疗药物环磷酰胺联合用药抗肿瘤疗效明显高 于环磷酰胺单独用药的抗肿瘤效果。结果表明EPS对消化道系统肿瘤有显著治疗作用，同 时提高荷瘤小鼠的免疫功能，与多糖剂量呈正相关性。同时，在sl80腹水瘤小鼠的寿命延 长实验过程中，服用EPS的腹水小鼠生存质量提高，寿命明显延长。 【附图说明】 图1EPS1-1的高效凝胶渗透色谱图 图2EPS-2的高效凝胶渗透色谱图 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的黑根霉胞外多糖的制备方法如下：(1)取菌种保藏号为CGMCC NO.8436的黑根霉接种于PDA培养基中，在25～30℃的条件下活化培养3～5d，制得活化后的菌丝；将活化后的菌丝转接于液体培养基中，在25～30℃、100～200rpm/min的条件下培养5～10d，制得发酵液；(2)将步骤(1)制得的发酵液经固液分离，收集分离后的液体，经浓缩后，在室温条件下，向浓缩液中加入3～4倍体积的体积百分比为95％的酒精，静置后，分离沉淀，将沉淀溶于蒸馏水中，再次分离沉淀，取上清液，制得粗提液；(3)将步骤(2)制得的粗提液经D301‑R型树脂柱脱色，收集洗脱液，然后加入洗脱液体积1/4的Seveage试剂振荡脱蛋白，取上清液，除去有机溶剂，制得粗糖溶液，然后将粗糖溶液经过Sephadex G‑50葡聚糖凝胶柱层析纯化，经蒸馏水洗脱，流度为5mL/min，检测合并收集高峰区的多糖洗脱液，将洗脱液进行浓缩、冷冻干燥，制得黑根霉胞外多糖。
【技术特征摘要】
1. 一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用，其特征在于，所 述的黑根霉胞外多糖的制备方法如下： (1) 取菌种保藏号为CGMCC NO. 8436的黑根霉接种于PDA培养基中，在25?30°C的条 件下活化培养3?5d，制得活化后的菌丝；将活化后的菌丝转接于液体培养基中，在25? 30°C、100?200rpm/min的条件下培养5?10d，制得发酵液； (2) 将步骤（1)制得的发酵液经固液分离，收集分离后的液体，经浓缩后，在室温条件 下，向浓缩液中加入3?4倍体积的体积百分比为95%的酒精，静置后，分离沉淀，将沉淀溶 于蒸馏水中，再次分离沉淀，取上清液，制得粗提液； ⑶将步骤⑵制得的粗提液经D301-R型树脂柱脱色，收集洗脱液，然后加入洗脱液体 积1/4的Seveage试剂振荡脱蛋白，取上清液，除去有机溶剂，制得粗糖溶液，然后将粗糖溶 液经过Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱层析纯化,经蒸馈水洗脱，流度为5mL/min,检测合并收 集高峰区的多糖洗脱液，将洗脱液进行浓缩、冷冻干燥，制得黑根霉胞外多糖。2....
【专利技术属性】
技术研发人员：陈靠山，侯东，于志丹，禹文茜，陈国创，石磊，周南，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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