制备主要组织相容性复合物基因修饰小鼠的方法技术

本发明专利技术提供了一种表达人源/非人源嵌合MHC 1多肽和/或人或人源化的β2微球蛋白多肽的基因修饰非人动物，以及包含该基因修饰的胚胎、细胞和组织。还提供了用于制备所述基因修饰动物的构建体以及制备该构建体的方法。本发明专利技术同时提供了使用所述基因修饰动物对人免疫系统的不同方面进行研究的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备主要组织相容性复合物基因修饰小鼠的方法相关申请的交叉引用本申请要求申请日为2011年10月28日的美国临时专利申请号61/552,582和61/552,587以及申请日为2012年9月14日的美国临时专利申请号61/700,908的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。
本专利技术涉及基因修饰的非人动物例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，其表达人源或人源化的主要组织相容性复合物(MHC)I类分子。本专利技术还涉及基因修饰的非人动物，例如小鼠或大鼠，其表达人源或人源化的MHCI蛋白(例如MHCIα链)和/或人源或人源化的β2微球蛋白；及表达人源或人源化的MHCI蛋白(例如MHCIα链)和/或人源或人源化的β2微球蛋白的胚胎、组织和细胞。本专利技术进一步提供了一种制备基因修饰的非人动物的方法，所述动物表达人源或人源化的MHCI类蛋白(例如MHCIα链)和/或β2微球蛋白。本专利技术还提供了一种在体外人源化细胞免疫系统或基因修饰的非人动物中鉴定和评估肽的方法，以及修饰非人动物例如小鼠或大鼠的MHCI和/或β2微球蛋白基因座以表达人源或人源化的MHCI和/或β2微球蛋白的方法。
技术介绍
在适应性免疫应答中，通过B淋巴细胞(例如免疫球蛋白)和T淋巴细胞(例如T细胞受体或TCR)上的受体分子识别外来抗原。这些外来抗原在细胞表面上以特定蛋白的肽片段递呈，通常将其称为主要组织相容性复合物(MHC)分子。MHC分子由多个基因座编码，已发现其为跨距约4Mb的连锁的基因簇。在小鼠中，MHC基因位于17号染色体上，并且由于历史原因被称为组织相容性2(H-2)基因。在人中，该基因位于6号染色体上，被称为人白细胞抗原(HLA)基因。在小鼠和人中，所述基因座是多基因的，其包括三个在人和小鼠基因组中具有相似构造的高多态性类型的MHC基因(I、II和III类)(分别参见图2和图3)。MHC基因座在基因组中显示出最高的多态性；一些基因通过＞300个等位基因代表(例如人HLA-DRβ和人HLA-B)。全部I类和II类MHC基因均能递呈为肽片段，但是各基因表达具有不同结合特性的蛋白，这反映了多态性和等位基因变体。在免疫应答过程中任何具有独特肽片段范围的给定个体均能够递呈被递呈至B和T细胞的细胞表面。人与小鼠均具有I类MHC基因(参见图2和图3)。在人中，经典的I源基因被称为HLA-A、HLA-B和HLA-C，而在小鼠中被称为H-2K、H-2D和H-2L。I类分子由两条链组成：多态性的α-链(有时被称为重链)和被称为β2-微球蛋白的较小的链(也被称为轻链)，其通常不具有多态性(图1)。这两条链在细胞表面上形成非共价的异源二聚体。所述α-链包含三个结构域(α1、α2和α3)。α链基因的外显子1编码先导序列，外显子2和3编码α1和α2结构域，外显子4编码α3结构域，外显子5编码跨膜结构域，而外显子6和7编码胞质尾区。α-链形成含有α1和α2结构域的肽结合缝隙(类似于Ig-样结构域)接着为类似于β2-微球蛋白的α3结构域。β2微球蛋白是一种非糖基化的12kDa蛋白；其功能之一在于稳定MHCI类α-链。与α-链不同，所述β2微球蛋白不跨膜。所述人源β2微球蛋白的基因座在15号染色体上，而鼠源的基因座在2号染色体上。β2微球蛋白的基因由4个外显子和3个内含子组成。循环形式的β2微球蛋白存在于血清、尿液和其他体液中；因此，非共价MHCI结合的β2微球蛋白在生理条件下能够与循环β2微球蛋白进行交换。I类MHC分子在所有有核细胞中表达，包括肿瘤细胞。其特异性地在T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞以及其他细胞上表达并且其功能为在CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表面展示肽片段(长度通常为8-10个氨基酸)。CTL通过其自身的膜结合TCR特异性地杀伤携带MHCI结合肽的任意细胞。当细胞展示非正常存在的细胞蛋白来源的肽(例如病毒、肿瘤或其他非自身来源)时，这种肽被CTL所识别，CTL被激活并杀伤展示该肽的细胞。通常，由于存在耐受机制，递呈正常(即自身)蛋白在MHCI分子环境下的递呈不会引发CTL的激活。然而，在一些疾病(例如癌症、自身免疫性疾病)中来源于自身蛋白的肽成为免疫系统的靶细胞成分，结果导致递递呈这种肽的细胞受到破坏。尽管在识别一些激发细胞免疫应答的自身来源抗原(例如与多种癌症相关的抗原)的方面已有进展，但是为了改进通过MHCI类分子被人CTL所识别的肽的鉴定，仍需要体内和体外系统来模拟人源细胞免疫系统的各个方面。模拟人源细胞免疫系统的系统可用于鉴定与疾病相关的抗原从而开发人体治疗产品例如疫苗和其他生物制品。在人源免疫系统中评估抗原识别的系统能够辅助鉴定对治疗有用的CTL群(例如对研究和防治人类疾病是有用的)。这种系统还能够辅助增强人CTL群的活性以便更有效地对抗感染和携带外来抗原的实体。因此，需要一种能够产生免疫系统的生物系统(例如基因改造的动物)，所述免疫系统展示模拟人免疫系统功能的组分。专利技术概述本申请提供了一种用于产生或鉴定肽的生物系统，所述的肽与MHCI类蛋白及其嵌合体相联，并且与CD8+T细胞结合。本申请提供了一种非人动物，其包含表达在细胞免疫应答中具有功能的人源或人源化的分子的非人细胞。本申请还提供了编码人源或人源化的MHCI和β2微球蛋白的人源化的啮齿动物基因座。本申请还提供了表达人源或人源化的MHCI和β2微球蛋白的人源化的啮齿动物细胞。本申请提供了包含人源化的啮齿动物细胞的体内和体外系统，其中所述啮齿动物细胞表达一个或多个人源或人源化的免疫系统分子。本申请提供了一种非人动物例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，在其基因组中包含编码人源/非人源(例如人/啮齿动物，例如人/小鼠或人/大鼠)嵌合MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人源部分包含人MHCI多肽的胞外结构域。具体的说，本专利技术提供了一种非人动物，其在内源性MHCI基因座包含编码人源/非人源嵌合MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人源部分包含人MHCI多肽的胞外结构域，并且其中所述动物表达人源/非人源嵌合MHCI多肽。在一个方面，所述动物在内源性非人源MHCI基因座不表达内源性非人源MHCI多肽的胞外结构域。在本专利技术的一个方面，所述非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)包含两个拷贝的MHCI基因座，其中包含编码人源/非人源(例如人/啮齿动物，例如人/小鼠或人/大鼠)嵌合MHCI多肽的核苷酸序列。在本专利技术的另一个方面，所述动物包含一个拷贝的MHCI基因座，其中包含编码人源/非人源嵌合MHCI多肽的核苷酸序列。因此，所述动物针对包含编码人源/非人源嵌合MHCI多肽的核苷酸序列的MHCI基因座可以是纯合子或杂合子。在不同的实施方式中，编码人源/非人源嵌合MHCI多肽的核苷酸序列被包含在非人动物(例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)的生殖细胞中。在一个方面，所述编码人源/非人源嵌合MHCI的核苷酸序列可操作地与内源性非人源调控元件连接，例如启动子、增强子、沉默子等。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人源部分包含人先导序列。在另一个实施方式中，所述嵌合多肽的人源部分包含人MHCI多肽的α1、α2和α3结构域。所述人MHCI多肽可以选自以下组：HLA-A、HLA-B和HLA-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非人动物，其特征在于，所述动物在内源性主要组织相容性复合物I(MHC I)基因座包含编码人源/非人源嵌合MHC I多肽的核苷酸序列， 其中所述嵌合多肽的人源部分包含人MHC I多肽的胞外结构域，并且 其中所述非人动物表达人源/非人源嵌合MHC I多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.10.28 US 61/552,587;2011.10.28 US 61/552,582;1.一种制备基因修饰非人动物的方法，包括修饰非人动物的基因组以使其在内源性主要组织相容性复合物I(MHCI)基因座包含编码人源/非人源嵌合MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人源部分包含人MHCI多肽的α1、α2和α3结构域，并且其中所述非人动物表达人源/非人源嵌合MHCI多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰步骤包括在所述内源性MHCI基因座用编码人源MHCI多肽的α1、α2和α3结构域的核苷酸序列取代编码非人源MHCI多肽的α1、α2和α3结构域的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述非人动物不表达来自内源性非人源MHCI基因座的内源性非人源MHCI多肽的α1、α2和α3结构域。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码人源/非人源嵌合MHCI多肽的核苷酸序列可操作地与内源性非人源调控元件连接。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述人源/非人源嵌合MHCI多肽的人源部分包含人源前导序列。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述人MHCI多肽选自以下组：HLA-A、HLA-B和HLA-C。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述人MHCI多肽是HLA-A多肽。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述人源/非人源嵌合MHCI多肽的非人源部分包含内源性非人源MHCI多肽的跨膜和胞质结构域。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述非人动物是啮齿动物。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述内源性基因座是小鼠H-2K基因座。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述嵌合人源/非人源MHCI多肽的非人源部分包含内源性小鼠H-2K多肽的跨膜和胞质结构域。13.根据权利要求10所述的方法，其中所述修饰步骤在单个ES细胞中进行，并且将所述单个ES细胞引入小鼠胚胎以制备小鼠。14.一种制备基因修饰非人动物的方法，包括修饰非人动物基因组以使其包含：编码人源/非人源嵌合MHCI多肽的第一核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人源部分包含人MHCI多肽的α1、α2和α3结构域；以及编码人或人源化的β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列位于内源性非人源MHCI基因座，并且所述第二核苷酸序列位于内源性非人源β2微球蛋白基因座，并且其中所述非人动物表达所述人源/非人源嵌合MHCI多肽和所述人或人源化的β2微球蛋白多肽。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述修饰步骤包括在所述内源性MHCI基因座用编码人MHCI多肽的α1、α2和α3结构域的核苷酸序列取代编码非人源MHCI多肽的α1、α2和α3结构域的核苷酸序列；并且在所述内源性非人源β2微球蛋白基因座用所述编码人或人源化的β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列取代编码非人源β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述非人动物不表达来自内源性非人动物基因座的内源性非人源MHCI多肽的α1、α2和...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·麦克唐纳，A·J·莫菲，C·古雷尔，J·麦克沃克，V·沃罗宁那，F·哈里斯，S·史蒂文斯，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US