本发明专利技术公开了一种HRM分析技术检测硫嘌呤类药物个体化用药相关基因多态性的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，设计包含目标位点的检测引物，根据HRM分析技术对PCR扩增后的基因序列进行位点分型。本发明专利技术灵敏度高、特异性好，检测速度快，可用于为硫嘌呤类药物的临床用药剂量提供参考，从而达到合理有效地个体化用药。
【技术实现步骤摘要】
HRM分析技术检测硫嘌呤个体化用药基因多态性的方法
本专利技术涉及硫嘌呤类药物个体化用药相关基因多态性的检测方法，属于分子生物学
。
技术介绍
硫嘌呤类药物，如6-巯基嘌呤(6-mereaptopuring,6-MP)及其前体药物硫唑嘌(azath1purine,AZA)等，常用于治疗血液系统恶性肿瘤、自身免疫性疾病以及器官移植术后的排斥反应。此类药物本身无生物活性，在体内经过一系列代谢反应生成具有药理活性的6-巯基嘌呤核苷酸(6-th1guanine nucleotides, 6-TGN),能够干扰核苷酸代谢,具有抗增殖和免疫抑制作用，也是引起骨髓抑制等毒副作用的主要原因。硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)在硫嘌呤类药物的体内代谢中起着重要作用，其活性直接影响药物的疗效和毒副作用的产生。临床上给予标准剂量的嘌呤类药物治疗时，对于TPMT活性高的病人，则可能因为硫嘌呤类药物用量不足，出现在维持治疗期间复发；而对于TPMT活性低下或者缺失的病人，则会导致骨髓抑制等毒副作用。因此美国FDA推荐，在接受硫嘌呤类药物治疗前，患者应该接受TPMT基因分型检测，非野生型患者应尽量避免硫嘌呤类药物的使用，从而预防严重毒副作用的发生。TPMT基因定位于6p22.3，全长34kb，包含10个外显子和9个内含子。迄今已发现30多种突变型等位基因(TPMT*2-TPMT*34)与TPMT酶活性降低相关。野生型纯合子(TPMT*1)决定酶的高活性，杂合子表现为中度活性，突变型纯合子的酶活性极低甚至缺失。其中 TPMT*2 (G238C)、TPMT*3A (G460A、A719G)、TPMT*3B (G460A)和 TPMT*3C (A719G)四种基因型约占中度和低酶活性表型的80%~95%。ΤΡΜΤ*3Α基因型个体TPMT活性完全丧失，ΤΡΜΤ*3Β和TPMT*3C个体TPMT催化活性分别降低9和1.4倍，研究表明TPMT中等活性和低活性个体只能接受10-50%的平均巯嘌呤化疗剂量。TPMT*3C (A719G)为中国人群中主要的等位基因突变类型，可导致TPMT酶活性降低，从而增加硫嘌呤类药物产生毒副作用的可能性。因此，对TPMT的基因检测有助于临床合理确定硫嘌呤类药物的用量和正确评估该药在特定个体可能产生的毒副作用。 本专利技术应用一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法——高分辨熔解曲线(High resolut1n melting, HRM)分析技术。通过实时监测升温过程中双链DNA突光染料与PCR产物的结合情况，SNP位点碱基不同会使双链DNA的TM值发生变化从而双链DNA在升温过程中先后解开，形成不同的熔解曲线形状，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，结果准确，且实现了真正的闭管操作。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简单易行的硫嘌呤类药物个体化用药相关基因多态性的检测方法。为了达到上述目的，本专利技术提供一种利用HRM分析技术检测硫嘌呤类药物个体化用药相关基因(硫嘌呤甲基转移酶)多态性的方法，其特征在于，具体步骤为: 第一步:采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul。第二步:采用在线软件Primer 3设计HRM引物，确定最佳引物为18_25bp大小，PCR产物长度80-150bp。相关引物信息如下: TPMT rsl 142345 引物序列:rsl142345-F GGTTGATGCTTTTGAAGAACGrsl142345-R CCTCAAAAACATGTCAGTGTGA 第三步:在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul，正、反向引物溶液各0.5ul(10umol/L)，检测样品2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul ;在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92-97°C变性5-15分钟，92_97°C变性10-30秒，57_65°C退火10-30秒，70-75°C延伸 10-30秒，30-50个循环；HRM反应条件:92_97°C变性I分钟，40°C复性I分钟，初始熔解温度60-65 °C开始程序升温熔解至95 °C，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒。第四步:应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果,通过标准曲线基于曲线偏移(纯合子)和曲线形状变化(杂合子)展现不同的基因型。定义已知样本基因型后，软件会自动调出所有检测样本的基因型。本专利技术对TPMT rsll42345位点的基因型进行检测，为硫嘌呤类药物的临床用药剂量提供参考，从而达到合理有效地个体化用药。本专利技术基于HRM分析技术，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料，操作简单，不仅具有灵敏度高、特异性好、成本低、检测速度快、高通量等优点，而且分辨率高，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染。【附图说明】图1为本专利技术实施例大样本的HRM标准曲线图； 图2为本专利技术实施例大样本的HRM差异曲线图。【具体实施方式】以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1、采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到lOng/ul ； 阴性对照DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定TPMT rsl 142345位点基因型为AA ； 阳性对照I DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定TPMT rsl 142345位点基因型为AG ； 阳性对照2 DNA符合以下条件时视为合格:0D值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定TPMT rsl 142345位点基因型为GG。2、采用在线软件Primer 3设计引物，确定最佳引物为18_24bp大小，PCR产物长度70-150bp，目标位点周边位置避免其他SNP位点(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。用无菌水配制浓度为lOumol/L的TPMT rsll42345正向引物溶液以及浓度为lOumol/L的TPMT rsll42345反向引物溶液；正向引物的序列为:5 '-GGTTGATGCTTTTGAAGAACG-3'，反向引物的序列为:5' - CCTCAAAAACATGTCAGTGTGA -3'。3、在每一个PCR反应孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul(QIAGEN公司生产，包括 2 X HRM PCR Master Mix、10XPCR 缓冲液、Q-solut1n、EvaGreen Dye、HotStarTaq DNA聚合酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种HRM分析技术检测硫嘌呤类药物个体化用药相关基因多态性的方法，其特征在于包括以下成分：（1）TPMT rs1142345基因座PCR扩增与测序引物，（2）TPMT rs1142345座PCR探针2对，（3）PCR扩增试剂，（4）阳性参照，（5）阴性参照。
【技术特征摘要】
1.一种HRM分析技术检测硫嘌呤类药物个体化用药相关基因多态性的方法，其特征在于包括以下成分:(I) TPMT rsll42345基因座PCR扩增与测序引物，(2) TPMT rsll42345座PCR探针2对，(3) PCR扩增试剂，(4)阳性参照，(5)阴性参照。2.根据权利I所述的检测方法，其特征在于:采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul。3.根据权利I所述的检测方法，其特征在于:采用在线软件Primer3设计HRM引物，确定最佳引物为18-25bp大小，PCR产物长度80-150bp ;相关引物信息如下: TPMT rs 1142345 引物序列:rsl142345-F GGTTGATGCTTTTGAAGAACGrsl142345-R CCTCAAAAACATGTCAGTGTGA。4.根据权利I所述的检测方法，其特征在于:...
【专利技术属性】
技术研发人员：傅咏南，张奕，毛丹丹，王校，卞雪莲，乐涵骏，
申请(专利权)人：上海中优医药高科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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