一种水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器制造技术

本发明专利技术公开了一种水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器，其是由以下方法获得：（1）将β-双酮溶于漆酶溶液A中，得到溶液C；（b）向三口烧瓶中加入烯类共聚单体、交联剂和溶液C；（c）向三口烧瓶中通入惰性气体反应10-20min，后置于15℃~65℃恒温水浴30-90min，获得水凝胶；（d）将水凝胶水洗4-8遍，置于-50℃~-80℃冷冻干燥至恒重，即获得水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器；本发明专利技术获得的水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器，具有吸附与降解功能，可促进水体中的污染物与酶促反应体系的接触，提高降解效率，且避免了因漆酶被动适应载体所导致的酶构型变化甚至活性的降低，漆酶固载率高于90%，酶活回收率达11.2%。

【技术实现步骤摘要】
一种水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器
本专利技术属于聚合物水凝胶、生物技术与环境功能复合材料领域，特别是一种水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器。
技术介绍
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，能催化氧化多种难降解的有机污染物（李阳，蒋国翔、牛军峰，王颖，呼丽娟.漆酶催化氧化水中有机污染物.化学进展，2009,21（10）,2028-2036.），具有降解底物广泛、能耗低、易操作、环境友好等优点，已经在有机废水处理领域显示出良好的应用前景（PhilippeDemarche，CharlesJunghanns，RakeshR.Nair，SpirosN.Agathos.Harnessingthepowerofenzymesforenvironmentalstewardship.BiotechnologyAdvances，2012,30（5），933-953.）。然而，漆酶的水溶性及随环境条件而变性失活的不稳定性限制了漆酶在废水处理中的应用。酶的固定化是实现酶重复连续使用和稳定性改善的有效手段，目前已发展出多种制备固定化酶的方法，主要有吸附法、包埋法、共价结合法以及交联法，这些方法各有优缺点，其中包埋法是将酶物理包埋于高聚物网格或微囊内的一种固定化方法，一般反应条件温和，对酶自身的结构改变少，酶活性损失较小，固定化效率较高，应用相对较为成熟；微囊包埋法主要用于医学治疗，不适合废水处理工程的应用；采用合成高分子的凝胶包埋法一般需要使用引发剂或交联剂，而试剂的残留会影响到凝胶的性质；此外，包埋法的缺点是高聚物网格会对大分子物质产生扩散阻力，导致固定化酶动力学行为改变，使酶活力降低，因此，载体（包埋剂）的选择是酶固定化技术中的一个关键问题。一种理想的固定化酶载体需要满足如下要求：维持酶的催化活性和专一性；与酶的结合牢固；机械强度好；有最小的空间位阻；稳定，不与底物和产物反应；廉价、环境友好，在研究较多的凝胶包埋法中，常用的包埋剂主要有天然高分子类物质（如琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、明胶、几丁质）和合成类高分子物质（如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等）。研究表明，琼脂强度较差；明胶内部结构密实、传质性能差；卡拉胶稳定性较差、易降解；聚丙烯酰胺凝胶的单体对生物有毒性；聚乙烯醇凝胶的机械强度和传质性能均较好，对生物无毒，且耐生物分解。但是，单用聚乙烯醇与硼酸交联成球困难，易成絮状体，且成球后，球体机械强度较差。壳聚糖因其在自然界中资源丰富、来源经济、具有良好的生物相容性、与其它天然材料相比更抗拒微生物分解、具有良好的热稳定性和机械操作性、诸多基团可以修饰的独特性能，倍受广大国内外研究者的关注，已有多种通过物理或化学手段制备壳聚糖水凝胶的方法。近年来，由天然高分子与合成高分子共混制备的水凝胶显示出良好的应用前景。但是，目前为止真正可用于实际废水处理的酶固定化载体并不多。究其原因，在于现有的方法局限于将酶被动负载在载体表面或包裹在载体内部的技术思路，被束缚的酶在被动适应其存在的固定化空间时被迫发生构象甚至化学结构的改变，从而使酶活力降低。此外，漆酶虽然具有宽泛的底物专一性，但除酚类化合物外，漆酶对底物的氧化降解需要借助中间介体的作用（KumarasamyMurugesan,Yoon-YoungChang,Young-MoKim,Jong-RokJeon,Eun-JuKim,Yoon-SeokChang.Enhancedtransformationoftriclosanbylaccaseinthepresenceofredoxmediators.WaterResearch，2010，44，298-308.）。酶的固定化虽然为酶的重复和连续使用提供了解决方案，但是，长期以来在酶的固定化研究中，介体的选择和使用这一关键问题却被忽略了，至今未见将漆酶与介体同时固定于某一载体的相关文献报道，因此，如何研制一种新型的使酶能够自主选择固定化空间的漆酶-介体体系复合材料，是本领域一个亟需解决的关键科学问题。
技术实现思路
针对上述问题，提供一种具有吸附与降解功能的水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器，以促进水体中污染物与酶促反应体系的接触，提高降解效率，本专利技术是这样实现的：一种水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器，其特征在于，所述水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器是通过以下步骤获得的：a）将β-双酮溶于漆酶溶液A中，得到溶液C，溶液C即为自由基引发体系；溶液C中漆酶酶活为3~10U/ml，β-双酮浓度为50~500mM；b）向三口烧瓶中加入烯类共聚单体、交联剂和漆酶总酶活不低于20U的溶液C，形成水凝胶前驱体溶液，水凝胶前驱体溶液中交联剂的质量为烯类共聚单体质量的3.0%-20.0%；c）向三口烧瓶中通入惰性气体反应10-20min，后将三口烧瓶置于15℃~65℃恒温水浴30-90min发生聚合反应，获得水凝胶；d）将步骤c获得的水凝胶水洗4-8遍，置于-50℃~-80℃冷冻干燥至恒重，即获得一种新型复合材料，定义为水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器。优选的，本专利技术中，步骤a中所述漆酶溶液A是将漆酶溶于醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH为3.6~5.8）、醋酸溶液（pH为3.6~5.8）、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液（pH为5.8~7.0）、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（pH为3.6~7.0）、纯水中的一种获得的。优选的，本专利技术中，步骤a中所述β-双酮为乙酰丙酮，改变乙酰丙酮的浓度可以控制复合材料的机械强度。优选的，本专利技术中，步骤b中，所述烯类共聚单体为丙烯酰胺，交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。优选的，本专利技术中，步骤c中，所述惰性气体为氮气或氩气。优选的，本专利技术中，步骤b中，步骤b中，所述水凝胶前驱体溶液中还包括溶液B；所述溶液B是将壳聚糖溶于乙酸溶液而获得壳聚糖浓度为5-25g/L的溶液；水凝胶前驱体溶液中烯类共聚单体与壳聚糖的质量比为30:1~3:1，交联剂的质量为烯类共聚单体和壳聚糖质量总和的3.0%-20.0%。优选的，本专利技术中，所述乙酸溶液浓度为0.5%~1.0%。本专利技术针对漆酶被动适应载体空间所导致构型变化甚至酶活性降低的问题，通过漆酶-介体体系引发原位组装合成水凝胶，将漆酶和介体同时原位组装于具有三维网状结构的水凝胶中，使漆酶能够自主选择固定化空间，与现有的漆酶固定化技术相比，本专利技术提供的水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器具有以下优点：（1）本专利技术制备的水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器是通过漆酶-介体体系引发原位组装而成，避免了因漆酶被动适应载体所导致的酶构型变化甚至活性的降低，反应条件温和，漆酶固定化效率高于90%，酶活回收率达11.2%，漆酶固载稳定，漆酶析出率低于1%。（2）本专利技术制备的水凝胶固定化漆酶-介体酶促反应器中，壳聚糖接枝丙烯酰胺水凝胶为三维网状结构，其在为漆酶提供附着支撑的同时，对水体中的部分污染物具有良好的吸附作用，可促进污染物与酶促反应体系的接触，提高降解效率。（3）本专利技术通过漆酶-介体体系启动和调控壳聚糖与丙烯酰胺的聚合反应，将漆酶和介体同时原位组装于具有三维网状结构的水凝胶中，形成了完备的漆酶-介体酶促反应器，克服了漆酶在降解具有较高氧化还原电位污染物时，需要外部投加氧化还原介体的难题。附图说明图1为实施例3、4、5中水凝胶固定化漆酶-介体酶促反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水凝胶固化漆酶‑介体酶促反应器，其特征在于，所述水凝胶固化漆酶‑介体酶促反应器是通过以下步骤获得的：a）将β‑双酮溶于漆酶溶液A中，得到溶液C，溶液C中漆酶酶活为3~10 U/ml，β‑双酮浓度为50~500 mM；b）向三口烧瓶中加入烯类共聚单体、交联剂和漆酶总酶活不低于20U的溶液C，形成水凝胶前驱体溶液，所述水凝胶前驱体溶液中交联剂的质量为烯类共聚单体质量的3.0%‑20.0%；c）向三口烧瓶中通入惰性气体反应10‑20min，后将三口烧瓶置于15℃~65℃恒温水浴30‑90min，获得水凝胶；d）将步骤c获得的水凝胶水洗4‑8遍，置于‑50℃ ~ ‑80℃冷冻干燥至恒重，即获得水凝胶固化漆酶‑介体酶促反应器。

【技术特征摘要】
1.一种水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器，其特征在于，所述水凝胶固化漆酶-介体酶促反应器是通过以下步骤获得的：a）将β-双酮溶于漆酶溶液A中，得到溶液C，溶液C中漆酶酶活为3~10U/ml，β-双酮浓度为50~500mM；所述漆酶溶液A是将漆酶溶于醋酸-醋酸钠缓冲溶液、醋酸溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液或纯水中的一种获得的；所述β-双酮为乙酰丙酮；b）向三口烧瓶中加入烯类共聚单体、交联剂和溶液B，形成水凝胶前驱体溶液；所述溶液B是指将壳聚糖溶于乙酸溶液而获得壳聚糖浓度为5-25g/L的溶液；其中，水凝胶前驱体溶液中烯类共聚单体与壳聚糖的质量比为30:1~3:1，交联剂的质量为烯类共聚单体和壳聚糖质...

【专利技术属性】
技术研发人员：张淑娟，孙洪飞，阳花，傅博文，潘丙才，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32