本发明专利技术公开了一种定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法。通过对DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的检测来反映核酸的甲基化水平：6-甲基氨基嘌呤的存在会降低DNA复制和RNA逆转录时的底物活性，在DNA复制和RNA转录过程中，有甲基化位点出现时，将不会发生链延伸；因此，可以通过掺入脱氧核苷三磷酸进行链延伸来达到区分甲基化和非甲基化序列的目的，同时可以对DNA和RNA的特定位点的甲基化水平做出定量评估。本发明专利技术可很好地用在DNA和RNA的核苷酸分离中的6-甲基氨基嘌呤分析上，是一种简便的检测DNA和RNA中腺嘌呤甲基化程度的方法。
【技术实现步骤摘要】
—种定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法
本专利技术属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法。
技术介绍
表观遗传学是在研究与经典孟德尔遗传法则不相符的生命现象过程中逐步发展起来的一门学科，又称为“拟遗传学”、“表遗传学”、“外遗传学”或“后遗传学”，主要研究在细胞核中脱氧核糖核酸(DNA)没有改变的情况下对于功能可逆的、可遗传的改变。甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程，可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。DNA的甲基化是表观遗传学的一种机制，它通过特定的甲基化酶将甲基加在DNA分子上，如胞嘧啶的5’碳上，甲基化之后的DNA序列在复制、转录及翻译的过程中都不会发生改变，但是却会改变最终的遗传表现。甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调苄基因的表达和关闭，与癌症、衰老 、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。研究证实，CpG 二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)和少量的6-甲基氨基嘌呤(N6-甲基腺嘌呤，Iii6A)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。甲基化修饰同样也会发生在RNA水平上。RNA同时具有调控和信息分子的双重功能，在众多细胞机制中发挥着核心的作用，例如作为遗传信息的信使，催化生化反应，作为细胞结构骨架等。RNA转录后的修饰为RNA功能的多样化奠定了化学基础，2011年更新的RNA修饰数据库RNAMDB共收录了 109种RNA的修饰形式，其中甲基化修饰占80%，最常见的是发生在信使RNA (mRNA)中腺苷的N6位置上(m6A)，但被研究得不是很多。6-甲基氨基嘌呤是发生在碱基A第六位N原子上的甲基化，最早是在细菌DNA中发现的。1955年Dunn等人在观察胸腺嘧卩定的结构类似物对Bacterium coli 15T的影响时，发现DNA复制过程中出现了一种新碱基。将DNA水解后利用二维纸层析方法进行碱基分离时，除了得到四种常见的碱基(A、T、C、G)外，还发现了第五个紫外吸收点。经过多重实验鉴定，对应于该吸收光点的新碱基为N6-甲基腺嘌呤。同时，在其他一些菌株和噬菌体中也检测到了 6-甲基氨基嘌呤的微量存在。1958年，Dunn等人在研究Bacterium coli RNA中的非自然碱基时也同样分离到了 6-甲基氨基嘌呤。另外，在多种高等真核真核生物以及病毒的mRNA中都检测到m6A的存在。6-甲基氨基嘌呤如此广泛的存在让我们很难忽视它的生物学意义和重要性，从而进行更深入的研究。传统认识认为，由于被甲基化的碱基A没有改变它的碱基配对能力，目前还不能通过直接测序来检测，也没有发现它有独特的的化学反应。如DNA中的5-甲基胞嘧啶经过亚硫酸氢盐法处理后会发生碱基变化从而可以通过测序检测。所以之前的检测方法一直是基于放射性标记技术，即将甲基供体S-腺苷甲硫氨酸进行放射性标记，并于待处理的细胞进行孵育，随后通过薄层色谱(TLC)或高效液相色谱(HPLC)来检测。但是这种方法既昂贵又繁琐，效率又低，而且无法实现大规模的基因检测及确切的甲基化位点的定位，局限性很大。因此，发展新型的甲基化碱基A的检测方法，方便、快捷、低成本地对其进行检测，十分重要。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的缺陷和不足，提供一种方便、低成本的定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法。本专利技术基于引物延伸法和凝胶电泳法的原理对DNA和RNA中6_甲基氨基嘌呤进行检测，其检测原理是:含有6-甲基氨基嘌呤的模板链在延伸时会降低底物的活性，使延伸减慢；同时在含有甲基化的位点与模板链互补配对的互补链不能发生延伸；通过反应时间的不同，可以区分甲基化和非甲基化的序列，同时也可以对特定位点的甲基化水平进行定量评估。一种定位定量检测DNA和RNA中6_甲基氨基嘌呤的方法，包括如下步骤: 1)进行DNA复制反应:向含有2~10mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10~50 mM的硫酸铵、1~10 mM的氯化钾 、2(T100 mM的硫酸镁和2(T100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲溶液中加入DNA聚合酶、引物、三磷酸脱氧核糖核苷酸和DNA模板链，形成DNA复制反应体系，其中，DNA复制反应体系中各物质的浓度:DNA聚合酶为0.2~0.5 U，引物为200~500 nM，三磷酸脱氧核糖核苷酸为100~400 μ M，DNA模板链为0.3~3 mM ；DNA复制反应体系在5(T70°C中延伸反应20~60 min ； 2)进行RNA逆转录反应:向含有2~10mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1(T50 mM的硫酸铵、f 10 mM的氯化钾、2(T100 mM的硫酸镁和2(T100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲溶液中加入RNA聚合酶、引物、三磷酸核糖核苷酸、RNA酶抑制剂和RNA模板链，形成RNA逆转录反应体系，其中，RNA逆转录反应体系中各物质的浓度:RNA聚合酶为0.2^0.5 U，引物为200^500 nM、三磷酸核糖核苷酸为100~400 μ M，RNA酶抑制剂为0.2~0.5 U，RNA模板链为0.2^3 mM ;其中，RNA聚合酶和RNA酶抑制剂浓度比为1:1 ；RNA逆转录反应体系在5(T70°C中延伸反应20~60 min ； 3)定位定量检测6-甲基氨基嘌呤:分别向步骤I)的DNA复制反应体系和步骤2)的RNA逆转录反应体系中加入猝灭剂使延伸反应终止，然后在8(T100 0C孵育1(T30 min，冷却至室温，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以检测出DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的数量；根据引物链和其延伸链的相对位置，可以确定DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的特定位点。所述的DNA模板链为不含6-甲基氨基嘌呤的DNA和含6_甲基氨基嘌呤的DNA。[0011 ] 所述的RNA模板链为不含6-甲基氨基嘌呤的RNA和含6_甲基氨基嘌呤的RNA。所述的三磷酸脱氧核糖核苷酸为脱氧胸苷三磷酸、三磷酸脱氧尿苷、5-羟甲基脱氧尿三磷酸或5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸。所述的DNA聚合酶为牛生长激素聚合酶时，DNA复制反应体系中加入耐热聚合酶反应缓冲液(ThermoPol?)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X_100)，DNA复制反应体系中耐热聚合酶反应缓冲液的体积分数为50%、聚乙二醇辛基苯基醚的浓度为lwt%。所述的DNA聚合酶为克列诺片段聚合酶时，DNA复制反应体系中加入双酶切缓冲液(NEBuffer2)和2.5倍缓冲溶液体积的二硫苏糖醇，DNA复制本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定位定量检测DNA和RNA中6‑甲基氨基嘌呤的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）进行DNA复制反应：向含有2~10 mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10~50 mM的硫酸铵、1~10 mM的氯化钾、20~100 mM的硫酸镁和20~100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲溶液中加入DNA聚合酶、引物、三磷酸脱氧核糖核苷酸和DNA模板链，形成DNA复制反应体系，其中，DNA复制反应体系中各物质的浓度：DNA聚合酶为0.2~0.5 U，引物为200~500 nM，三磷酸脱氧核糖核苷酸为100 ~ 400 μM，DNA模板链为0.3 ~ 3 mM；DNA复制反应体系在50~70℃中延伸反应20~60 min；2）进行RNA逆转录反应：向含有2~10 mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10~50 mM的硫酸铵、1~10 mM的氯化钾、20~100 mM的硫酸镁和20~100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲溶液中加入RNA聚合酶、引物、三磷酸核糖核苷酸、RNA酶抑制剂和RNA模板链，形成RNA逆转录反应体系，其中，RNA逆转录反应体系中各物质的浓度：RNA聚合酶为0.2~0.5 U，引物为200~500 nM、三磷酸核糖核苷酸为100 ~ 400 μM， RNA酶抑制剂为0.2~0.5 U， RNA模板链为0.2~3 mM；其中，RNA聚合酶和RNA酶抑制剂浓度比为1:1；RNA逆转录反应体系在50~70oC中延伸反应20~60 min；3）定位定量检测6‑甲基氨基嘌呤：向步骤1）的DNA复制反应体系和步骤2）的RNA逆转录反应体系中加入猝灭剂使延伸反应终止，然后在80~100 oC孵育10~30 min，冷却至室温，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以检测出DNA和RNA中6‑甲基氨基嘌呤的数量；根据引物链和其延伸链的相对位置，可以确定DNA和RNA中6‑甲基氨基嘌呤的特定位点。...
【技术特征摘要】
1.一种定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)进行DNA复制反应:向含有2~10mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10~50 mM的硫酸铵、f 10 mM的氯化钾、2(T100 mM的硫酸镁和2(T100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲溶液中加入DNA聚合酶、 引物、三磷酸脱氧核糖核苷酸和DNA模板链，形成DNA复制反应体系，其中，DNA复制反应体系中各物质的浓度:DNA聚合酶为0.2~0.5 U，引物为200~500 nM，三磷酸脱氧核糖核苷酸为100~400 μ M，DNA模板链为0.3~3 mM ；DNA复制反应体系在5(T70°C中延伸反应20~60 min ； 2)进行RNA逆转录反应:向含有2~10mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10~50 mM的硫酸铵、f 10 mM的氯化钾、2(T100 mM的硫酸镁和2(T100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲溶液中加入RNA聚合酶、引物、三磷酸核糖核苷酸、RNA酶抑制剂和RNA模板链，形成RNA逆转录反应体系，其中，RNA逆转录反应体系中各物质的浓度:RNA聚合酶为0.2^0.5 U，引物为200^500 nM、三磷酸核糖核苷酸为100~400 μ M，RNA酶抑制剂为0.2~0.5 U，RNA模板链为0.2~3 mM ;其中，RNA聚合酶和RNA酶抑制剂浓度比为1:1 ;RNA逆转录反应体系在5(T70°C中延伸反应20~60 min ； 3)定位定量检测6-甲基氨基嘌呤:向步骤I)的DNA复制反应体系和步骤2)的RNA逆转录反应体...
【专利技术属性】
技术研发人员：周翔，王少儒，田沺，王佳琪，翁小成，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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