一种对丝状菌形态和代谢活性的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种对丝状菌形态和代谢活性的检测方法，步骤如下：（1）将丝状菌接种发酵培养；（2）培养到48-72h时，取100-150μL发酵液，300-400目网筛过滤冲洗，去除发酵液中有色杂质干扰；（3）过滤后菌丝置于小离心管中，加生理盐水稀释至1-2mL，吸取100-150µL均匀涂在载玻片上；（4）滴加200-250μL改良亚甲基蓝染色液，染色10-15min；（5）滴加100-150μL改良石炭酸品红染色液，染色5-8min；（6）蒸馏水冲洗玻片，盖片观察。本发明专利技术通过染色手段，更加方便形态学的观察，同时可以明显区分菌体生长某一阶段不同区域活性差异，对其生理代谢活性大致了解。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种丝状菌发酵过程的实时监控方法，特别是涉及一种丝状菌的菌丝形态和代谢活性的检测方法。
技术介绍
人类利用真菌已经有相当长的历史，但是直到第一次世界大战以后，随着液体发酵技术的兴起，丝状真菌发酵才逐渐在工业领域蓬勃发展起来。到如今，丝状真菌在发酵工业中被广泛用于抗生素(青霉素、头孢霉素等)、有机酸(柠檬酸、葡萄糖酸、延胡索酸等)和酶制剂(淀粉酶、果胶酶、纤维素酶等)的生产，这些产品在医药、食品和其他工业领域都有着很大的需求。在发酵过程中，丝状菌形态变化情况复杂，在生长的不同阶段呈现出截然不同的形态结构。在生长初期，营养体结构通常是一根管状细丝，由孢子萌发而成，称为菌丝；随着菌体的生长，菌丝开始出现分叉，最终形成若干菌丝，称为菌丝体。在液体发酵中，菌丝体形态除了由菌种本身的遗传物质决定，还取决于接种体的性质和所处的发酵环境，包括培养基组成、温度、PH值和机械剪切力等等。一般来说，最极端的菌丝体形态有两种，即大量菌丝体集聚成球和分散的菌丝体。菌丝体形态的改变对于发酵过程来说非常重要，它将直接影响营养的消耗和氧气的吸收速率。并且，菌丝体的形态会对发酵液的流体力学产生显著作用，从而影响生物反应器的性能。研究表明，丝状生长使得发酵液粘度升高，而高粘度会明显降低发酵液中汽液两相之间的质量传递速率；而球状生长使得发酵液呈现较低粘度，从而大大降低获得相同搅拌和氧气传递的能耗。伴随着球状生长出现的问题是，球体内部的菌丝体会由于营养缺乏发生自溶现象，从而影响细胞代谢和产物合成。对于某些产物而言，为了获得最高的产量，需要菌丝体呈现特定的形态，比如同样是利用黑曲霉发酵，对于生产果胶酶而言，丝状生长更适合；而对于生产柠檬酸而言，则球状生长更为适合。除了菌丝体形态以外，为了最大程度地获得代谢产物，还需要对菌体的生长特征和生理活性有详细的了解。每株菌本身的生理生长各不相同，而且不同代谢产物的获得所需的生理条件也各有差别。对于每次发酵而言，为了获得最高产量，就必须对菌体的生理活性和生长阶段实现精确的控制。近些年来，随着对形态发生过程中代谢控制和生长动力学的了解越来越深入，人们越发认识到要想在工业生产中改进发酵控制，实现产量的提高，就必须建立一种可以充分反映菌丝体形态特征和代谢活性的方法。这种方法必须能将菌体生长代谢、发酵过程参数、形态特征定量和产物合成动力学模型等有机地联系起来。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可实时检测发酵过程中菌丝形态和代谢活性的方法。利用这种方法可以检测在当前的发酵过程参数下，菌丝体的形态和生长代谢的状况。通过对形态特征和菌丝体不同活性区域的定量分析，可帮助实现产物合成动力学模型的建立，从而为生产实践提供参考，具有一定的指导意义。本专利技术所提供的方法，操作简单，包括如下操作步骤: (1)将丝状菌接种发酵培养； (2)取100-150μ L发酵液，300-400目网筛过滤冲洗，去除发酵液中有色杂质干扰； (3)过滤后菌丝置于小离心管中，加生理盐水稀释至l_2mL，吸取100-150μL均匀涂在载玻片上； (4)滴加200-250μ L改良亚甲基蓝染色液，染色10-15min ； (5)滴加100-150μ L改良石炭酸品红染色液，染色5-8min ； (6)蒸馏水冲洗玻片，盖片观察，显微镜拍照成像； (7)活性区域分割统计:将目标图像进行灰度化处理，得到灰度图，灰度范围0-255，对灰度图进行归纳统计，按照灰度值分为四个区域，0-90，90-150, 150-210, 210-255分别对应细胞高活性区域，细胞稳定区域、细胞衰退区域和细胞死亡区域，并统计各区域的像素点，进而计算出不同活性区域在细胞中比例。所述改良亚甲基蓝染色液的制备方法如下:取0.3_2g亚甲基蓝溶于50ml无水乙醇中，过滤，得到亚甲基蓝储藏液；然后取5ml储藏液与42-44.5ml无水乙醇充分混合，加入0.5-3ml冰醋酸溶液，再加入100-300 μ L的0.lmol/L的二硫苏糖醇或还原性谷胱甘溶液。得到所述改良亚甲基蓝染色液。所述改良石炭酸品红染色液的制备方法如下:称取3g碱性品红，研细，加入95%乙醇10ml中，放置过夜,滤纸过滤；取该液1ml,与5%石炭酸水溶液80ml混合,加入5%碳酸氢钠溶液10ml，山梨醇lg，得到改良石炭酸品红染色液。本专利技术中在对菌丝体进行染色之前，进行了一步过滤冲洗操作。300-400目网筛的粒度为37-50μπι，用它进行过滤菌丝体可以几乎无损失地保留，只过滤掉发酵液中玉米浆等有色杂质，从而减少染色观察的背景干扰。亚甲基蓝经活性线粒体氧化成为无色，因此可以作为反映细胞活性的指示剂。为了保持菌丝形态，本专利技术亚甲基蓝染料中加入少量冰醋酸用于维持细胞形态。由于空气及溶液中存的活性氧自由基也可导致的褪色，本专利技术加入微量二硫苏糖醇或还原性谷胱甘肽溶液做为还原性保护剂，可以排除空气及溶液中活性氧自由基导致的褪色作用，有效的增加菌丝颜色的对比度，提高实验的准确性。为了区分同样呈无色的高活性和死亡区域，采用石炭酸品红复染的方法。石炭酸品红可将细胞质部分染成橙红色。本专利技术在石炭酸品红溶液中加入少量碳酸氢钠做为稳定剂，加入少量山梨醇做为助渗剂。复染的结果是:高活性区域主要呈现橘红色，随着活性的降低，颜色逐渐变深，且染色效果可保持I小时以上。本专利技术的优点: (1)本专利技术操作简单，步骤少，去除干扰后，采用改良染色剂染色及复染后效果对比明显，持续时间长，检测方便快速； (2)本专利技术所需发酵液样品量少，不会影响整个发酵过程； (3)本专利技术对菌丝进行染色，更加方便形态学的观察，无论是分散菌丝还是成球菌丝体，都很容易在镜下观察其形态特征；同时，可以明显区分菌体生长某一阶段不同区域活性差异，对其生理代谢活性大致了解；(4)本专利技术采用了染色分割的方法，更加有利于图像处理软件的应用，是进行形态特征定量和代谢分析的一种很好的前处理手段，可以作为建立相应数学模型的基础。【附图说明】图1a-未染色产黄青霉菌丝；图1b-改良亚甲基蓝染色后产黄青霉菌丝；图1c-改良石炭酸品红复染产黄青霉菌丝。 图2a_亚甲基蓝先染，石炭酸品红复染黑曲霉霉菌丝；图2b_改良亚甲基蓝先染，改良石炭酸品红复染黑曲霉霉菌丝。图3a_未染色米根霉菌丝；图3b_改良亚甲基蓝先染，改良石炭酸品红复染米根霉菌丝。图4a_经过灰度化处理后的米根霉菌丝；图4b_以灰度图进行活性分区的米根霉菌丝。【具体实施方式】实施例1 以产黄青霉为出发菌株，依次按照下列步骤进行操作: 作为出发菌，依次按照下列步骤进行操作: A、首先在摇瓶中进行种子液的制备，然后将种子液接种于装有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，培养基成分为玉米衆(50%干重)46.5g/L,乳糖130g/L,碳酸钙10g/L,磷酸二氢钾4 g/L，硫酸铵4.5 g/L，硫酸钠1.5 g/L，玉米油4滴，苯乙酸铵(10%)2滴，在pH 5.8，25 °C条件下，以220r/min的搅拌速度培养； B、培养到72h时，吸取10PL发酵液，300目网筛过滤冲洗，去除发酵液中有色杂质干扰； C、过滤后菌丝置于小离心管中，加生理盐水稀释至lmL，吸取100μL均匀涂在载本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对丝状菌形态和代谢活性的检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将丝状菌接种发酵培养；（2）培养到48‑72h时，取100‑150μL发酵液，300‑400目网筛过滤冲洗，去除发酵液中有色杂质干扰；（3）过滤后菌丝置于小离心管中，加生理盐水稀释至1‑2mL，吸取100‑150µL均匀涂在载玻片上；（4）滴加200‑250μL改良亚甲基蓝染色液，染色10‑15min；（5）滴加100‑150μL改良石炭酸品红染色液，染色5‑8min；（6）蒸馏水冲洗玻片，盖片观察，显微镜拍照成像；（7）活性区域分割统计：将目标图像进行灰度化处理，得到灰度图，灰度范围0‑255，对灰度图进行归纳统计，按照灰度值分为四个区域，0‑90,90‑150,150‑210,210‑255分别对应细胞高活性区域，细胞稳定区域、细胞衰退区域和细胞死亡区域，并统计各区域的像素点，进而计算出不同活性区域在细胞中比例。

【技术特征摘要】
1.一种对丝状菌形态和代谢活性的检测方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将丝状菌接种发酵培养； (2)培养到48-72h时，取100-150μ L发酵液，300-400目网筛过滤冲洗，去除发酵液中有色杂质干扰； (3)过滤后菌丝置于小离心管中，加生理盐水稀释至l_2mL，吸取100-150μL均匀涂在载玻片上； (4)滴加200-250μ L改良亚甲基蓝染色液，染色10-15min ； (5)滴加100-150μ L改良石炭酸品红染色液，染色5-8min ； (6)蒸馏水冲洗玻片，盖片观察，显微镜拍照成像； (7)活性区域分割统计:将目标图像进行灰度化处理，得到灰度图，灰度范围0-255，对灰度图进行归纳统计，按照灰度值分为四个区域，0-90，90-150, 150-210, 210-255分别对应细胞高活性区域，细胞稳定区域、细胞衰退区域和细胞死...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑之明，王鹏，胡以华，顾有林，王辉，王丽，刘红霞，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：安徽;34